Vectores de ADN

recombinante:
plsmidos.
JAVIER CORONEL
LUIS F. GONZLES
ERNESTO MARTNEZ
DIEGO A. OSORIO
NSTOR RENGIFO

Plsmidos
En las clulas procariotas
existe una secuencia de
genes externos al
cromosoma de la bacteria
que se llaman plsmidos.
Estos tpicamente
contienen unas pocas
docenas de genes y
tienen diferentes
caractersticas.

Partes de un plsmido

Vectores de ADN recombinante

Unvectores de ADNes
unamolculatransportadora
que transfiere y replica partes
deADNque llevan insertados
mediante tcnicas deADN
recombinante. Para que sirva
de vector, una molcula debe
ser capaz de replicarse junto
con el fragmento de ADN que
transporta. Tambin tiene que
tener secuencias de
reconocimiento que permitan
la insercin del fragmento de
ADN

Por qu utilizar plsmidos como

vectores de ADN recombinante?

Debido a que los plsmidos

tienen sistemas de replicacin
y expresin independientes
del ciclo celular, el insertar
genes objetivo dentro de
estos permite observar la
expresin del gen en diversos
organismos, produciendo la
protena para la que codifica
y realizar varias copias del
mismo mediante el
mecanismo de replicacin
celular autnomo.

Por qu utilizar plsmidos como

vectores de ADN recombinante?
El proceso de ADN recombinante
con plsmidos se utiliza en los
siguientes campos:

- Regulacin de la expresin
gnica.

- Produccin industrial de sntesis

de protenas como la insulina
y la
hormona del crecimiento.

- Desarrollo de organismos
transgnicos.

Amplificacin del ADN (es mas

efectiva la tcnica PCR)

Las etapas en la produccin de ADN

recombinante son las siguientes:
hormona del crecimiento.

Preparacin de la secuencia del ADN para su clonacin

Preparacin de un vector de clonacin.

Formacin del ADN recombinante.

Introduccin del ADN recombinante en una clula anfitriona.

Propagacin del cultivo.

Deteccin y seleccin de clones recombinantes.

Preparacin de la secuencia del

ADN para su clonacin

Se lisan las clulas y se extrae las molculas de ADN.

El ADN obtenido se concentra y se fragmenta en los lugares

necesarios para su unin por accin de las enzimas de restriccin.

Se asla el ADN que se desea clonar o expresar mediante

cromatografa lquida o por centrifugacin.

Si el ADN debe expresarse hay que aadir los segmentos de la

expresin gnica.

Preparacin de la secuencia del ADN

para su clonacin: Enzimas de
restriccin
Las enzimas de restriccin fueron
descritas por primera vez en los
aos 70. Su descubrimiento dio
un gran impulso al estudio del
ADN.

Estas enzimas pertenecen al

grupo denominador Nucleasas o
Fosfodister, ya que actan
selectivamente en sitios de
reconocimiento.

Los extremos generados por el

corte pueden ser romos (no
tienen bases desapareadas en los
extremos ) o por el contrario
pueden tener extremos cohesivos

Preparacin de un vector de
clonacin.

Aislar el plsmido

Identificar los puntos de

restriccin donde se tratara con
enzimas de restriccin para que
acepte la secuencia de ADN.

Revisar el gen marcador que

identifique y con el que pueda
seleccionar las clulas clonadas.
Un ejemplo de marcador puede
ser la resistencia a un antibitico.

Revisar que el vector se replique

de manera independiente al ADN
de la clula anfitriona.

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Preparacin de un vector de
clonacin: Proceso de introduccin.
Las etapas del proceso
consisten en:

Cortar el vector con las

enzimas de restriccin, las
mismas enzimas que se
utilizaron para cortar el ADN
que se quiere insertar para
obtener extremos adhesivos
coherentes.

Unir el vector y el Fragmento

de ADN que se quiere clonar
mediante ligasas.

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Introduccin del ADN recombinante

en una clula anfitriona.

Para la clonacin o replicacin del

ADN recombinante, se necesita de
la maquinaria celular. Por ello hay
que introducir el ADN recombinante
en una clula anfitriona. Los
mtodos comunes para este
proceso son:

1.

Transformacin

2.

Micro-inyeccin

3.

Lipofeccin

4.

Electroporacin

5.

Transfeccin

6.

Biobalstica

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Introduccin del ADN recombinante

en una clula anfitriona.
Los

tipos de clulas
usadas como
anfitrionas son:

Clulas bacterianas

Clulas eucariotas
1.Levaduras
2.Clulas

tumorales

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Propagacin del cultivo y seleccin

de los clones recombinantes.

Se induce la divisin de
celular de las clulas
anfitrionas, de forma que
tambin se producen copias
de ADN recombinante ,
debido a la propiedad de los
plsmidos, y por ello se da la
clonacin.

Al final se hace necesario

separar las clulas que
contienen ADN recombinante
de las que no lo contienen.

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Propagacin del cultivo y seleccin

de los clones recombinantes.
Los

mtodos para
detectar y
seleccionar son:

Mtodo de
hibridacin

Mtodo inmunolgico

Mtodos genticos

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Bibliografa

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