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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS


ASIGNATURA:

TEMA:

BIOLOGA
MOLECULAR

MULTIPLEX PCR Y SUS APLICACIONES


INTEGRANTES::

Profesor:
Profesor:
Biol. Sal
Sal Escobar
Escobar
Biol.

Grupo 1 Cuarto
Semestre
GUAYAQUIL - ECUADOR

Sandy Durazno
T.

Allison Franco
C.

Michael Flores
C.

Armando de la

MULTIPLEX PCR
(Reaccin en cadena de la
polimerasa mltiple)

Es una modificacin
de la reaccin en
cadena de la
polimerasa con el fin
de detectar
rpidamente
deleciones* o
duplicaciones en un
gran gen.

En un ensayo de
Es una tcnica de
multiplexacin, ms
biologa molecular
de una secuencia
generalizada para la
diana puede ser
amplificacin de
amplificado mediante
mltiples objetivos en
el uso de mltiples
un nico experimento pares de cebadores
de PCR.
en una mezcla de
reaccin.

Como una extensin


para el uso prctico
de PCR, esta tcnica
tiene el potencial de
producir un ahorro
considerable en
tiempo y esfuerzo en
el laboratorio sin
comprometer la
utilidad del
experimento.

*Deleccin: es un tipo especial deanomala estructural cromosmica que consiste en la prdida de un

fragmento deADNde
uncromosoma.

Este proceso amplifica genmicas de ADN muestras usando mltiples


cebadores y una temperatura mediada por la ADN polimerasa en un ciclador
trmico .
Multiplex-PCR fue descrito por primera vez en 1988 como un mtodo para
detectar deleciones en el distrofina gen. Tambin se ha utilizado con el
esteroide sulfatasa gen. En 2008, multiplex-PCR se utiliz para el anlisis de
microsatlites.

*Distrofina: es una protena que previene el dao en las memranas de las clulas musculares.

Multiplex-PCR consta de mltiples conjuntos de cebadores dentro de


una nica mezcla de PCR para producir amplicones(porciones de
Adn o ARN ampliados) de tamaos que son especficos para
diferentes secuencias de ADN diferentes.
Al dirigirse a mltiples genes a la vez, la informacin adicional
puede ser obtenida a partir de una nica prueba que de otra
manera requerira varias veces los reactivos y ms tiempo para
llevar a cabo.
Kits de multiplexacin Comercial en PCR estn disponibles y
utilizados por muchos laboratorios forenses para amplificar
muestras de ADN degradadas.

TIPOS DE MULTIPLEX PCR


Las reacciones de multiplexacin se pueden dividir en dos grandes
categoras:
Se utiliza mltiples
plantillas y varios
conjuntos de
cebadores en el
mismo tubo de
reaccin.La
presencia de
mltiples
cebadores puede
dar lugar a
hibridacin cruzada
entre s y con la
posibilidad de
errores de cebado
con otras plantillas.
Reaccin
Reaccin 2.
2. Mltiple
Mltiple
reaccin
reaccin de
de PCR
PCR Template
Template

Reaccin
Reaccin 1.
1. PCR
PCR solo
solo
plantilla
plantilla

Esta tcnica utiliza


una nica plantilla
que puede ser un
ADN genmico
junto con varios
pares de cebadores
directo e inverso
para amplificar
regiones
especficas dentro
de una plantilla.

PARMETROS DE DISEO DE CEBADORES PARA


MULTIPLEX PCR
Primer
Longitud

Temperatura de
fusin

Ensayos
de
Multiplex
PCR
implican
el
diseo de un
gran nmero de
cebadores, por
lo
tanto,
se
requiere que el
cebador
diseado
debe
ser de longitud
apropiada.Por lo
general,
se
utilizan
cebadores
de
corta
longitud,
en el intervalo
de 18-22 bases.

Los
cebadores
con
Tm
similares,
preferiblemente
entre
55C
60C se utilizan.
Para
las
secuencias con
alto
contenido
de
GC,
se
recomiendan
cebadores
con
una Tm superior
(preferiblemente
75C - 80C).

Especificidad
Es
importante
tener en cuenta
la especificidad
de los primers
diseados a las
secuencias
diana,
sobre
todo
porque
existe
competencia
cuando
mltiples
secuencias
diana estn en
un
solo
recipiente
de
reaccin.

Evite Primer
formacin de
dmeros
Los
cebadores
diseados deben
ser
revisadas
para
la
formacin
de
dmeros
de
cebadores, con
todos
los
cebadores
presentes en la
mezcla
de
reaccin.La
dimerizacin
conduce a la
amplificacin
inespecfica.

VENTAJAS DE MULTIPLEX
PCR
Controles
Controles Internos
Internos
Los problemas potenciales en una PCR simple incluyen falsos negativos debido a
la falta de reaccin o falsos positivos debido a la contaminacin.Los falsos
negativos a menudo se revelan en ensayos multiplex porque cada uno
proporciona un control interno para los otros fragmentos amplificados.

Eficiencia
Eficiencia
El gasto de los reactivos y el tiempo de preparacin es menor en PCR multiplex
que en los sistemas donde se utilizan varios tubos de PCR UNIPLEX.Una reaccin
multiplex es ideal para la conservacin de la polimerasa costoso y plantillas
escasas.

Indicacin
Indicacin de
de la
la Calidad
Calidad de
de la
la Plantilla
Plantilla
La calidad de la plantilla se puede determinar de manera ms eficaz en multiplex
que en una reaccin de PCR simple.

Indicacin
Indicacin de
de la
la Cantidad
Cantidad de
de la
la Plantilla
Plantilla
La amplificacin exponencial y los estndares internos de multiplex PCR se
pueden utilizar para evaluar la cantidad de una plantilla determinada en una
muestra.

MULTIPLEX
MULTIPLEX PCR
PCR
(Ventajas
(Ventajas y
y Dificultades)
Dificultades)

La PCR mltiple persigue amplificar simultneamente en un nico tubo


distintas secuencias especficas o secuencias blanco o dianas, lo cual
necesariamente implica que los reactivos mezclados y el programa utilizado
sean suficiente y adecuados para permitir la deteccin de cada diana y no
inhibir la de las dems.
Con este fin, algunos parmetros, como la concentracin de magnesio y de
primers, y el tipo y la cantidad de ADN polimerasa, pueden ajustarse
experimentalmente. Para otros, en cambio, debe realizarse un diseo
exhaustivo previo.
En el caso de los cebadores y el programa de temperaturas
utilizado, es necesario tener en cuenta varias premisas:

a) Escoger o
disear
oligonucletidos
que no
interaccionen entre
s, es decir, que no
formen dmeros

b) Que tengan
temperaturas de
alineamiento
similares

c) Que cada
pareja amplifique
una nica
secuencia diana

d) Que generen
amplicones de tamao
suficientemente
diferente para
separarlos y
diferenciarlos tras la
amplificacin.

MULTIPLEX
MULTIPLEX PCR
PCR
(Ventajas
(Ventajas y
y Dificultades)
Dificultades)

En cuanto a la calidad y cantidad de ADN molde, se debe intentar partir de la


concentracin menor posible y con ausencia de sustancias inhibidoras que
puedan interferir en la reaccin. Para ello, los protocolos de purificacin
variarn en funcin del tipo de muestra de partida.
La PCR es una tcnica que, por su aparente simplicidad y su alta sensibilidad,
es muy susceptible de errores de ejecucin y de contaminaciones, por lo que
la introduccin de la PCR mltiple en los laboratorios de microbiologa requiere
una formacin especializada previa del personal que ejecute los anlisis.

APLICACIONES DE LA MULTIPLEX
PCR

Patgenos de
identificacin

Genotipado SNP
de alto
rendimiento

Anlisis de la
mutacin

Eliminacin de
Gen Anlisis

El anlisis de
ligamiento

La cuantificacin
de plantilla

Deteccin de
ARN

Estudios Forenses

METODOLOGA
MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO
Juego de amplificacin
Taq polimerasa (Taq-DNA-polimerasa recombinante; Fermentas), que se compone de:,
MgCl2, amortiguador enzimtico, desoxiribonucletidos (dNTPs), primer forward inlA (o
cebador inlA Fw) y primer reverse inlA (cebador inlA Rv), primer forward inlC (o
cebador inlC Fw) y primer reverse inlC (cebador inlC Rv), agua grado biologa
molecular.
Micropipetas (100 -1,000; 10 -100 y 0.5 -10 L)
Hielera con hielo frap
Microtubo de PCR 200 L
Microtubo 1.5 mL
Gradilla para microtubos.
Cajas con puntas amarillas NUEVAS (200 L)
Cajas con puntas azules NUEVAS (1,000 L)
Cajas con puntas ultramicro NUEVAS (10 L)
1 recipiente plstico para desechar puntas
Termociclador BioRad MyCycler
Guantes
DNA cromosomal obtenido de la extraccin del alimento enriquecido en el medio caldo
para enriquecimiento para Listeria.

PROCEDIMIENTO

Se trabajar con el DNA cromosomal extrado a partir del medio de


enriquecimiento de Listeria monocytogenes.
Colocar
Colocar el
el volumen
volumen de
de
DNA
templado
DNA templado descrito
descrito en
en
la
la tabla
tabla 1.
1.

Realizar
Realizar una
una
homogenizacin
homogenizacin final
final de
de
los
reactivos
mediante
los reactivos mediante la
la
aplicacin
aplicacin de
de unos
unos golpes
golpes
ligeros
ligeros en
en la
la parte
parte baja
baja
del
microtubo
del microtubo de
de PCR.
PCR.

Descongelar
Descongelar los
los reactivos
reactivos
colocndolos
colocndolos
previamente
previamente en
en
refrigeracin
refrigeracin o
o bien
bien en
en
bao
bao de
de hielo.
hielo.

Transferir
Transferir 49
49 L
L de
de la
la
master
mix
a
un
master mix a un
microtubo
microtubo para
para PCR.
PCR.

Colocar
Colocar los
los microtubos
microtubos
de
PCR
con
de PCR con la
la muestra
muestra a
a
amplificar
amplificar en
en el
el
termociclador
termociclador y
y realizar
realizar
la
programacin
la programacin descrita
descrita
en
en la
la tabla
tabla 2.
2.

Mantener
Mantener los
los tubos
tubos que
que
contienen
contienen la
la TaqTaqpolimerasa,
polimerasa, el
el ADN
ADN
templado,
los
primers
templado, los primers y
y
los
los dNTPs
dNTPs a
a 20
20 C
C hasta
hasta
el
el momento
momento de
de su
su uso.
uso.

Despus
Despus de
de colocar
colocar la
la Taq
Taq
polimerasa,
invertir
polimerasa, invertir el
el
microtubo
microtubo de
de la
la master
master
mix
2
o
3
veces
mix 2 o 3 veces evitando
evitando
la
la formacin
formacin de
de espuma
espuma
para
lograr
para lograr la
la
homogenizacin
homogenizacin de
de los
los
reactivos
reactivos

Al
Al trmino
trmino del
del proceso
proceso
de
amplificacin
de amplificacin colocar
colocar
los
microtubos
de
los microtubos de PCR
PCR en
en
congelacin
a
-20C
congelacin a -20C
hasta
hasta la
la realizacin
realizacin de
de la
la
electroforesis
en
gel
electroforesis en gel de
de
agarosa
agarosa 1%.
1%.

Centrifugar
Centrifugar brevemente
brevemente
los
los tubos
tubos antes
antes de
de
usarlos.
usarlos.

En
En el
el orden
orden especificado
especificado
en
la
tabla
en la tabla 1,
1, preparar
preparar en
en
un
microtubo
de
1.5
L
un microtubo de 1.5 L la
la
mezcla
mezcla de
de reaccin.
reaccin.

Se
Se realizar
realizar la
la mezcla
mezcla de
de
reaccin
(master
reaccin (master mix)
mix)
para
para la
la cantidad
cantidad de
de
muestras
a
amplificar..
muestras a amplificar..