API

SISTEMA DE IDENTIFICACION
DE MICROORGANISMOS

CLINICA Y APLICACIN
INDUSTRIAL

API 20 E es un sistema para la

identificacin de las Enterobacterias y otros
bacilos Gramnegativos no exigentes que
utiliza 23 test bioqumicos estandarizados y
miniaturizados, y una base de datos.

PRINCIPIO

API 20 E consta de 20 microtubulos conteniendo

substratos deshidratados. Estos test se inoculan con una
suspensin bacteriana la cual hidrata el medio. Durante la
incubacin, se producen cambios de color espontneos o
revelados por adicin de reactivos.

La lectura de las reacciones se hace de acuerdo con la

Tabla de lectura y la identificacin mediante el API20E
Index o el Programa informtico para la identificacin.

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

Orto-Nitrofenil--galactopiransido
ONPG

INTRODUCCION
Esta prueba se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de fermentar la lactosa. Los
microorganismos que fermentan la lactosa poseen dos enzimas especficos uno es la lactosa
Permeasa que est en la membrana celular y es capaz de transportar la lactosa a travs de la
membrana celular. La otra enzima es la B-D-Galactosidasa que est localizado en el interior de la
clula y desdobla la lactosa en glucosa y galactosa.
Los microorga nismos , segn fermente o no la lactosa, se pueden clasificar en :
Fermentadores activos de lactosa en 24 horas, los cuales poseen ambas enzimas.
No fermentadores de lactosa, carecen de ambas enzimas, no degradan la lactosa, no penetra en la
clula la lactosa.
Fermentadores tardos de lactosa, poseen la enzima B-D-Galactosidasa son capaces de
permeabilizar ligeramente la lactosa con concentraciones altas de lactosa y fermentarla en 2 a 15
das.
Para detectar en los microorganismos la enzima B-DGalactosidasa se utiliza un compuesto similar a la lactosa,
pero en su formula molecular se ha sustituido la glucosa
por el Orto-nitrofenol; ste, al liberarse al medio alcalino
por accin de la enzima B-D-Galactosidasa, si lo hubiera
en el microorganismo, produce un color amarillo.
ONPG (+): A los 60 minutos se observa un color amarillo.
ONPG (-): No se puede interpretar antes de las 24 horas.

Orto-Nitrofenil--galactopiransido
ONPG
REACCION:
Orto-Nitrofenil
-galactopiransido

-galactosidasa
Hidrlisis

Galactosa

+ OrtoniTrofenol
Amarillo

TECNICA:
Incoloro
Preparar una suspensin densa del microorganismo a
partir de un cultivo puro en 0.5 ml Solucin Fisolgica.
Liberar la B-D-Galactosidasa de las bacterias. Para ello
se aade una gota de tolueno a la suspensin y mezclar
vigorosamente durante unos segundos.
Aadir 0.5 ml de la solucin ONPG, mezclar.
Incubar a 37C y leer antes de 24 horas.
Debe utilizarse un inculo concentrado para que exista una concentracin alta de enzima
y aumentar la velocidad de reaccin.
La solucin de ONPG debe ser incolora y por ello debe prepararse en el momento .
La solucin debe guardarse en frascos de color topacio a una temperatura de 4C. pues es
fcilmente desestabilizante.
Antes de usarse se debe atemperar en un bao a 37C para que se disuelvan los fosfatos
que cristalizan durante la conservacin.

DESCARBOXILASA DE MOELLER
Lisina Arginina Ornitina
Las descarboxilasas son enzimas que actan sobre el grupo carboxilo de los
aminocidos Lisina, Ornitina, Arginina, para formar aminas y se desprende CO 2, este
proceso se realiza en anaerobiosis.Cada descarboxilasa acta sobre un aminocido.

La lisina descarboxilasa LDC es la enzima que acta

sobre la L-lisina obtenindose cadaverina y CO 2.
La ornitina descarboxilasa ODC es la enzima que
acta sobre la L-ornitina obtenindose putrescina y
CO2.
La arginina deshidrolasa es la enzima que cataliza
una hidrlisis de la L-arginina obtenindose L-citrulina
ms amonaco, para posteriormente sufrir una
descarboxilacin en la L-citrulina formndose
putrescina ms CO2.
En todas estas reacciones se desprende CO2 y se
alcaliniza el medio.

La liberacin de aminas se evidencia por un color rojo o prpura, en contraste con el

color amarillo del control y de los tubos con reacciones negativas.

Citrato de Simmons C.S.

INTRODUCCION
El citrato de sodio es una sal del cido ctrico, un
compuesto simple que constituye uno de los metabolitos
del ciclo de Krebs . Algunas bacterias pueden obtener
energa por va distinta de la de fermentacin de hidratos
de carbono, utilizando citrato como nica fuente de
carbono. La determinacin de esta caracterstica
importante para la identificacin
de muchas
enterobacterias.
TECNICA
Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un
medio e inocular en una sola ,estra en el pico del agro
citrato e incubar a 37C por 24 - 48 horas.
INTERPRETACION
El desarrollo de un color azul intenso en 24 a 48 horas
indica una prueba positiva y revela que el organismo en
estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el
medio, con la formacin de productos alcalinos.

Agar S.I.M.
Este medio de cultivo permite comprobar la formacin de sulfuro, la produccin de
indol y observar la movilidad.
PRODUCCION DE H2S
Se evidencia la formacin de cido sulfihidrico
por la formacin de un precipitado negro. Esto se
logra mediante las siguientes etapas:
Liberacin de sulfuro a partir del tiosulfato por
accin enzimtica de la bacteria.
Acoplamiento del sulfuro (S-2) con el ion
hidrogeno (H+) para formar gas H2S.
Deteccin del gas H2S mediante sales de metales
pesados como hierro, logrando la forma de sulfuro
del hierro, que es un precipitado negro.

Agar Urea
INTRODUCCIN:
Esta prueba detecta la presencia de la enzima ureasa en los
microorganismos a travs de una prueba en la que se observa la
alcalinizacin del medio.
La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea dando lugar a carbonato
amniaco, con lo que el medio se alcaliniza, a travs del cambio de color
del indicador de pH, por accin de la ureasa sobre la urea.
REACCION:
Urea
Ureasa
Anhidrido + Amonaco + Carbonato
carbnico
amnico
TECNICA:
Sembrar, el microorganismo en un tubo con agar urea de Christensen
inclinado. Incubar a 37C hasta detectar cambio de color del indicador.
INTERPETACION
Urea positiva: color rojo rosado debido al cambio de color del indicador
rojo fenol.
Urea negativa: No se produce viraje de color.

FENILALANINA DESAMINASA

INTRODUCCION
La fenilalanina es un aminocido que por desaminacin
forma un cetocido. El cido fenilpirvico.
De las enterobacterias slo los miembros de los grupos
Proteusy Providencia poseen la enzima fenilalanina
desaminasa, necesaria para esta conversin.
PRINCIPIO
La prueba de fenilalanina se basa en la deteccin de cido
fenilpirvico en el medio, tras el desarrollo del organismo en
estudio.
La prueba es positiva si aparece un color verde visible por
adicin de una solucin cloruro frrico al 10%.
El agar se vuelca en un tubo y se deja solidificar en pico de
flauta. No se pueden utilizar extractos de carne ni
hidrolizados de protenas debido a su contenido natural
variable de fenilalanina. El extracto de levadura sirve como
fuente de carbono y nitrgeno.
Al aadir FeCl, un color verde en la superficie del medio, como puede verse en el tubo de la
izquierda, indica la presencia de cido fenilpirvico (un producto de degradacin de la
fenilalanina del medio) por accin de la fenilalanina desaminasa.

INDOL
INTRODUCCION:
El indol, un bencilpirrol, es uno de los productos de degradacin metablica del
aminocido triptofno. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son
capaces de hidrolizar y desaminar el triptofno con produccin de indol, cido
pirvico y amoniaco.
La prueba de indol esta basada en la formacin de un complejo rojo cuando el
indol reacciona con el grupo del p-dimetilaminobenzaldehido. Este es el
principio activo del reactivo de Kovac y Erlich. Debe emplearse un medio rico
en triptofno.
COMPOSICION:
REACTIVO DE KOVAC
Alcohol amlico o isoamlico puro
150 ml
p-dimetilaminobenzaldehido 10 g
HCl concentrado 50 ml
TECNICA:
Inocular el caldo peptonado e incubar a 37C por 24 horas. Luego aadir 5
gotas del reactivo por la pared del tubo.
INTERPRETACION:
Positivo: El desarrollo de un color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el
caldo, indica la presencia del indol.

Voges Proskauer V.P.

INTRODUCCION
El cido pirvico, componente fundamental formado en la degradacin
fermentativa de la glucosa, es metabolizado luego a travs de varias vas, de
acuerdo con los sistemas enzimticos que poseen las diferentes bacterias.
Una de dichas vas lleva a la produccin de acetona (acetilmetilcarbinol),
un subproducto de reaccin neutra de la va Butilenglicol. Los organismos
que producen acetona como principal subproducto del metabolismo de la
glucosa y forman cantidades menores de cidos mixtos. En presencia de
oxgeno atmosfrico e KOH al 40% , la acetoina se convierte en diacetilo y
el alfa naftol acta como catalizador para revelar un complejo de color rojo.
COMPOSICION
ALFA-NAFTOL KOH
Alfa naftol
5g
KOH
40 g
Alcohol etlico absoluto
100 ml
Agua
100 ml
TECNICA
Inocular caldo MRVP e incubar a 37C por 24 horas. Luego aadir alfa
naftol e KOH al 40%. agitar el tubo y dejarlo en reposo por l0 minutos.
INTERPRETACION
Positivo: desarrollo de un color rojo a los l0 minutos, revelando la
presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona.

Hidrlisis de la Gelatina

Medio con gelatina de Kohn

Gelatina nutriente
Carbn inactivado en polvo fino
Agua destilada

TRIPLE AZUCAR HIERRO

T.S.I.

A. INTRODUCCION
La configuracin del medio en pico de flauta (Pico y
Fondo) determina la existencia de 2 compartimientos :
- La porcin inclinada, expuesta al oxgeno atmosfrico es
aerobia.
- La porcin inferior llamada fondo esta protegida del aire y
es relativamente anaerobia.
La porcin expuesta al oxigeno (INCLINADA), tiende a
tornarse alcalina por la descarboxilacin oxidativa de
protenas, y se desarrolla un pH alcalino y se vuelve rojo.
En el fondo del tubo donde no hay oxgeno , la degradacin
proteica es mnima y se pueden detectar incluso pequeas
cantidades de cido por la aparicin de un color amarillo.

La produccin de H2S se manifiesta por la produccin de un color negro.

La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio.
La acidez del medio se pone de manifiesto por un color amarillo y se representa por la letra A.
La alcalinidad del medio se pone de manifiesto por un color rojo y se representa por la letra K

Manitol Salado

Fermentacin del manitol

La fermentacin de manitol es producida por el S.

aureus y es til para diferenciarlo del S.
epidermidis.

La utilizacin del Manitol formando cido es

una caracterstica del S. Aureus.
Esta
propiedad
puede
evidenciarse
convenientemente
cultivando
el
microorganismo sobre un medio de cultivo
que involucre manitol.
Este medio es selectivo para el Staphylococus
debido a la alta concentracin de ClNa 7.5%.
El indicador es rojo de Fenol, a pH cido
(amarillo) y pH alcalino (Rojo)

HIDRATOS DE CARBONO

Los hidratos de carbono ms utilizados son:

Glucosa
Sacarosa
Manosa
Melibiosa
Inositol
Amgdaliana
Sorbitol
Arabinosa
Rammnosa
Se emplea caldo con indicador de pH
Metabolismo de los hidratos de carbono son cidos orgnicos

PRUEBA DE LA OXIDASA
A. INTRODUCCION
La enzima citocromo oxidasa participa en la transferencia de electrones en
la cadena respiratoria hacia el oxgeno.
O2 -------------H2O
O2 -------------H2O2
Se detecta oxidasa en los microorganismos aerobios o anaerobios
facultativos. Los anaerobios estrictos carecen de ella.
Los microorganismos aerobios obtienen su energa por la respiracin y la
almacenan en forma de ATP, el oxgeno es reducido a partir de un sustrato
orgnico que procede de la nutricin con la intervencin de un sistema de
transporte de electrones denominado cadena respiratoria, producindose
agua o perxido de hidrogeno segn la especia microbiana.

PRUEBA DE LA OXIDASA
Se determina a travs de esta prueba la presencia o ausencia de la enzima
Citocromo Oxidasa en el microorganismo, el cual cataliza el ltimo paso de
transferencia de electrones desde un substrato inorgnico (azcares, polipeptidos,
etc) al oxgeno.
Para ello se observar el cambio de color de un indicador de pH incoloro cuando
est reducido y coloreado cuando se oxida.
Entre los indicadore ms utilizados se encuentra la p-fenilendiamina, que por
accin de la enzima citocromo oxidasa da un compuesto qumico indofenol que
tiene color.

PRUEBA DE LA OXIDASA
REACCION:
p-fenilendiamina

Oxidasa

Indofenol coloreado

O2 atmosfrico

TECNICA:
Se cultiva en una placa petri con agar sangre el
microorganismo problema. Los medios que
contengan glucosa pueden inducir a falsos
resultados negativos debido a que la
fermentacin de la glucosa inhibe la actividad de
la oxidasa.
Sobre una placa petri vaca, colocar un trozo de
papel de filtro. La tira de papel de filtro
impregnada con el reactivo de Kovacs.
Con una asa se toma una colonia de la placa con
el cultivo del microorganismo y se extiende en el
papel. Se lee el resultado a los 30 a 60 segundos.
INTERPRETACION

Oxidasa (+): aparece un color purpreo en el papel a lo s 30 - 60 seg.

NITRATO REDUCTASA
CALDO NITRATO
1. COMPOSICION
Peptona
Cloruro de sodio
Agua destilada
Nitrato de potasio

AGAR NITRATO
8.6 g
6.4 g
1000 ml
10 g

2. DESCRIPCION DEL MEDIO

A. Requerimiento energtico:
B. Requerimiento no energtico
C. Segn su proporcin en agua
D. Segn su uso o utilizacin
E. Segn la composicin que presenta
F. Segn su presentacin

Extracto de carne
Peptona
Nitrato de potasio
Agar
Agua destilada

3g
5g
1g
12 g
1000 ml

REDUCCION DE NITRATOS
INTRODUCCIN
La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos
es una caracterstica importante utilizada para la
identificacin de especies de muchos microorganismos.
Estos microorganismos poseen la enzima nitrato reductasa o
nitratasa.
Todas la enterobacterias, excepto ciertos biotipos de
Enterobacter agglomerans y Erwinia, reducen nitratos.
Est presente en algunos microorganismos anaerobios o
anaerobios facultativos los cuales utilizan nitrgeno como un
ltimo aceptor de electrones en el proceso metabolico

PRINCIPIO
Los microorganismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxgeno
de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reduccin. La ecuacin
qumica es:
Nitrato (NO3-) +2e- + 2H ----- Nitrito (NO2-) + H2O
La presencia de nitritos en el medio se detecta aadiendo alfa-naftilamina y cido
sulfnlico, con la formacin de un colorante rojo de diazonio p-sulfobenceno azo-

REDUCCION DE NITRATOS
INTERPRETACIN
El desarrrollo de un color rojo a los 30 seg de aadir los reactivos
indica la presencia de nitritos y representa una reaccin positiva
para la reduccin de nitratos.
La ausencia de color tras el agregado de los reactivos puede
indicar una reaccin negativa o que han sido reducidos a
productos distintos de los nitritos, como amonaco, nitrgeno
molecular (desnitrificacin), xido ntrico (NO) u xido nitroso
(N2O), e hidroxilamina.
La reduccin de nitratos ha sido llevada hasta la formacin de
nitrgeno molecular; ste se observa en el interior de la campana
de Durham si el medio es lquido o por la aparicin de grietas o
burbujas en el caso de que el medio fuera slido.
En caso de ser negativo, debe agregarse una pequea cantidad de
zinc. Los iones Zinc reducen los nitratos a nitritos y el desarrollo
de un color rojo tras el agregado de Zinc indica la presencia de
nitratos residuales y confirma la reaccin negativa.

REDUCCION DE NITRATOS

INTERPRETACIN (MEDIO LIQUIDO)

Hay tres casos en los que la prueba se
considera positiva.
Cuando aparece color rojo o rosado al aadir el
reactivo A y B indica reduccin de nitratos a
nitritos.
Cuando aparece gas en la campana de Durham
indica reduccin de nitratos a nitrgeno
molecular.
Cuando al aadir zinc en polvo no se
desarrolla color indica formacin de otros
productos nitrogenados como: xido ntrico,
amonaco, hidroxilamina, etc.
La prueba es negativa cuando:
Se forma color rojo o rosado al aadir polvo
zinc en menos de 30 segundos. No se ha
reducido el nitrato. Para comprobarlo se aade
polvo de Zinc que acta como reductor y se
desencadena la reaccin colorimtrica.

Metodos computarizados

API

Permite investigar la
degradacin de hidratos de
carbono, utilizacin de
aminocidos, y la presencia de
enzimas con lo cual se puede
identificar el gnero y la
especie.

Metodos computarizados

DADE SCAN

Permite
investigar
la
degradacin de hidratos de
carbono,
utilizacin
de
aminocidos, y la presencia de
enzimas con lo cual se puede
identificar el gnero y la
especie.
Adems permite investigar la
sensibilidad
y
resitencia
antimicrobiana.