UEPR- CAMPUS FAFIPAR

Efeito de glifosato sobre o

desenvolvimento embrionrio de Xenopus
laevis (teratognese e glifosato)
Relatrio preliminar Andres E. Carrasco Molecular Embriologia
Laboratrio

ANDRIELE DOS SANTOS MAIA

MARISTELA DE LIMA BUENO

Paranagu

2012

Introduo
O comrcio mundial de pesticidas cresce a

cada ano. Embora muitas mudanas e

inovaes surjam conforme as necessidades
do mercado, entre elas o advento das culturas
transgnicas, resistentes a algumas pragas, o
uso de herbicidas destacado visto que a
maioria destas inovaes no impede o
florescimento de ervas daninhas no campo.

Introduo
Atualmente, o herbicida glifosato (N-(fosfonometil)

glicina, C3H8NO5P) no-seletivo, sistmico, psemergente, representa 60% do mercado mundial de

herbicidas no seletivos, contabilizando um total de
US$ 1,2 bilho/ano com vendas do produto.

Introduo
Um dos

mais comuns herbicidas usados na

agricultura, so do tipo Roundup contendo
glifosato em vrias concentraes mais
adjuvantes, detergentes que facilitam a
absoro de glifosato pela planta.

Introduo
Todos os detergentes ou surfactantes so txicos

para as clulas vivas, porque alteram sua

membrana e mudam suas propriedades alterando
a atividade metablica.

As experincias foram realizadas para estudar os

efeitos que podem ocorrer no desenvolvimento

dos vertebrados, particularmente durante o
perodo crtico de gastrulao, morfognese
( precoce).

introduo
As diluies recomendadas para a fumigao da

indstria agroqumica, variando de 1 a 2% da soluo

comercial (10 a20ml por litro) .

Na realidade, as diluies utilizadas hoje em dia so

acima destes valores (10% ou mais).

No entanto, difcil determinar qual a situao real

no modo de utilizao destes herbicidas, devido

falta de informao e de controle do uso de doses
necessrias nas culturas, no havendo estudos sobre
a progressiva resistncia de plantas daninhas,
biodegradao e possveis efeito no ambiente e na
sade humana.

Introduo
Estudos anteriores experimentais do dano celular

causado por glifosato em linhas de clulas

animais utilizando marcadores de enzimas de
dano mitocondrial (succinato desidrogenase) e
morte
celular
programada
(caspase
3/7)
mostraram o efeito txico em doses inferiores a
10 a 1000 vezes menores do que as utilizadas na
agricultura produzidas tanto pelo herbicida
comercial como glifosato puro.

(BENACHOUR et al, 2005;

BENACHOUR e
SERALINI, 1997; ERIC, 2009) .

introduo
A morte celular programada (apoptose) um

mecanismo que modula populaes e processos

de formao e construo embrionria, de diviso
celular, eliminando clulas que puderam se
alterar de uma forma indesejada, cooperar para
proporcionar e manter a forma do estruturas
durante o desenvolvimento do embrio.

Caspases so essenciais na apoptose celular,

um dos principais tipos de morte celular
programada durante o desenvolvimento

Outra contribuio reveladora realizada pelo grupo

SERALINI, argumenta que as diluies do herbicida

glifosato de ordem 1/1000 , podem destruir
membranas e causar danos mitocondriais em culturas
de clulas animais.

necessrio analisar rigorosamente o problema em

relao ao possvel efeito txico de misturas

comerciais de herbicidas, incluindo qual a
contribuio de glifosato puro sobre os possveis
efeitos que foram at agora observados.

Introduo
De acordo com SERALINI glifosato puro parece

atuar ao longo de primeiras 24 horas de

ativao das caspases e induzir a morte
celular (apoptose), em culturas de clulas,
com a dose de 500 a 1000 vezes menores do
que as utilizadas na agricultura e a 200 vezes
inferiores s necessrias para causar dano
membrana

Introduo
O glifosato pode interferir com um mecanismo, ainda

no explorado, que faz parte da fisiologia normal das

clulas no nosso modelo e, eventualmente, a
formao de tecidos e rgos, enviados de receptores
celulares especficos (intracelular ou membrana).

Alm

disso, chamou a ateno como uma

interferncia no mecanismo de reparo fisiolgico do
DNA que pode conduzir a acumulao e mutao em
alguns tipos de clulas aumentando o risco de
processos celulares malignos.

Introduo
O estudo do desenvolvimento embrionrio

ideal para determinar a concentrao de um

agroqumico, como o glifosato tanto para
estudar
mecanismos fisiolgicos que
conduzem a produzir clulas cancerosas ou
as alteraes durante o desenvolvimento,
como observado nesse estudo.

Objetivos

Descriminar a possvel atividade txica de

cada componente na mistura comercial e

determinar as semelhanas e as diferenas
entre os herbicidas e seus aditivos, e a ao
do glifosato puro.

Metodologia
Concentraes da soluo de herbicida:

A concentrao estimada de glifosato no

herbicida utilizado esta estimada entre 500 e
600 g / l.
Diluies para a pulverizao na agricultura

so definidos entre 1% e 30%.

Isto iguala sprays que variam de 6 g / litro a 200
g / l, respectivamente.

Metodologia
Anlise dos resultados e estratgias

empregadas:
1. Por imerso: como embries desenvolvem

num meio lquido, imerso numa soluo salina

semelhante ao ambiente natural, com as
diluies do herbicida comercial de 1/5000.
2.

Para microinjeo. Glifosato puro foi

injetada em uma das duas primeiras clulas
embrionrias. (PERUZZO et al, 2008 )

Metodologia
3. Marcadores moleculares.

Anlise de efeitos nos embries em diferentes

estgios de desenvolvimento foi realizada utilizando
a tcnica de hibridao in situ para detectar a
expresso especfica de genes marcadores de
territrios e populaes de clulas da placa neural
precoce,
formao
eixo
anteroposterior
embrionrio, estruturas rombencefallicas e crista
neural, etc.) O padro de formao da cartilagem
enceflica em girinos, foram analisados utilizando
colorao com azul Alcian.

Resultados
1. Embries de anfbios Xenopus laevis foram

incubadas por imerso no herbicida em

diluies de 1/5000, a partir de duas clulas
para anlise de fase experimental. A diluio
correspondente a doses de glifosato entre 50
e 1540 vezes menos do que os utilizados no
campo (nas faixas de diluio de 1% a 30%,
respectivamente) e 5000 vezes menores que
a soluo comercial. Doses maiores matam os
embries.

Resultados
2.

Embries de Xenopus laevis foram

injetados com 5 nl(nanolitro) de glifosato puro
em um blastmero no estdio de duas clulas
e deixa-se desenvolver a diferentes fases do
desenvolvimento embrionrio. O glifosato em
embries injetados representa cerca de
10.000 a 300.000 vezes menores do que as
utilizadas no campo (nas faixas de diluio
compreendida
entre
1%
e
30%,
respectivamente).

Resultados
Experincias de Imerso de Herbicida :
A reduo do comprimento do embrio, alteraes que
sugerem defeitos na formao do eixo embrionrio.

Alterao do tamanho da regio ceflica comprometendo

a formao do crebro e reduo dos olhos e alterao
dos arcos branquiais e placode auditiva.

A alterao dos mecanismos de formao da placa neural

evidenciado por uma diminuio nos neuronios primrios
que podem como anteriormente observados em outros
casos, afetar o desenvolvimento normal do crebro, tubo
neural ou outros dficits no sistema nervoso. (FRANCO et
al, 1999 e PAGANELLI et al,2001)

Resultados
Experimentos com glifosato puro:

Alteraes na formao e / ou especificao da

crista neural craniana. (A crista neural
craniana um conjunto de clulas ordenadas
em uma rea adjacente as bordas externas da
placa neural que tem como destino, entre
outros, com os arcos branquiais, a formao
de ossos e cartilagens facial).

Metodologia
Qualquer

alterao deformada pelo fracasso da

diviso celular ou a morte celular programada nesta
regio conduz a graves deformidades faciais.

No caso dos embries injetados observamos uma

diminuio nos marcadores de tecido embrionrio

compatvel com uma inibio da expresso do mesmo
ou de um nmero baixo de clulas.

Sugere-se que a consequncia disto vai resultar em

uma deformao da cartilagem (condrognese

craniana) ceflica que constituem um padro que
forma os ossos da face.

Metodologia
Isto compatvel com a alterao da morte

celular programada necessria para a

organizao
de
forma
e,
portanto,
malformaes do crnio, como sugerido em
estudos ecotoxicolgicos em anuros por
(LAJMANOVICH et al __).
O tubo intestinal mostra alteraes na rotao

e tamanho, bem como possveis mudanas na

regio cardiognica.

Discusso
A ao do glifosato em embries sugere um

efeito especfico que distorce ou altera os

processos biolgicos normais em regies e
tecidos especficos.

As doses utilizadas de glifosato so baixas oque

permite a especular que no so suficientes para

afetar membranas mitocondriais com a morte
celular em massa, mas ato com o tempo
necessrio para a ativao de caspases (enzimas
associadas a apoptose) que provocam a morte
celular programada em territrios especficos.

Discusso
Os

efeitos observados de glifosato puro, em

particular na crista neural cranial e os seus
derivados, que pode ser eficazmente compatveis
com alteraes na regulao da morte celular
programada tal como foi referido por outros
grupos de pesquisa e so particularmente
relevantes j que ressaltamos experimentos de
cultura celular do grupo de Seralini na Frana e
no trabalho do grupo da Universidade Nacional
del Litoral, em larvas de anfbios (Lajmanovich
Touro et al. Enviro. Contam Toxicologia., 2003).

Discusso
Os resultados deste grupo de anfbios so

incompatveis com as nossas observaes de

experimentos embriolgicos. Por conseguinte,
o fato de que nas experincias aqui
apresentadas, tanto o glifosato quanto o
herbicidas
comercial
afetam
o
desenvolvimento embrionrio afetando reas
embrionrias
discretas
(cabea,
olhos,
intestinos guelras) formadas por tecidos e
rgos especficos sugere que:

Discusso
1. Em cada ponto do desenvolvimento do
embrio grupos de clulas selecionadas
parecem ser mais sensveis ao glifosato do que
outros, provavelmente devido a diferentes
estados
de
funcionamento
(diferenciao,
proliferao ou migrao de clulas). Algumas
clulas podem ter mais sensibilidade do que
outros em um dado momento e possibilitando a
ser afetados por glifosato (por exemplo, as
populaes de clulas que esto em fase de
diviso celular ou a morte celular ou apoptose).

Discusso
2. Consequentemente, os efeitos observados
com doses aqui empregadas, em ambos os
experimentos no destruram completamente o
embrio (uma forma de morte celular massiva),
mas alteram com uma intensidade diferente a
forma e o desenvolvimento de regies
morfognicas discretas.

Discusso
3.
Outro
aspecto
a
salientar

que
concentraes muito baixas de glifosato tal
como aqui utilizado em relao aos utilizados
no solo, produzem no embrio efeitos
reprodutveis
tanto
morfolgicas
quanto
moleculares dimensionalmente. Pelo menos at
aonde
a
interpretao
dos
marcadores
moleculares permitiram-nos.

Discusso
4. Isto torna possvel interpretar que a
subsistncia dos efeitos aqui relatados,
produzido pelo glifosato, est associado com a
interferncia dos mecanismos normais de
regulao de desenvolvimento embrionrio.

Discusso
A conservao da mecnica, a regulao gentica,
especificao e determinao de reas e populaes
celulares durante o desenvolvimento embrionrio,
bem estabelecido desde os anos 80, com a
descoberta dos programas que conduzem a
morfognese (genes Hox) e os avanos na
interpretao de bases evolutivas de vertebrados
podem ser inferidas a partir do princpio da
preveno da cincia mdica que alteraes
descritas so efetivamente extrapolados para o
efeito sobre o desenvolvimento de qualquer
vertebrado.

Discusso
O princpio da precauo tem precedncia sobre

qualquer suspeita de danos na sade pblica. Os

experimentos de microinjeo com posterior
utilizao de marcadores moleculares de reas e/ou
populaes celulares com quantidades discretas e
controladas de glifosato puro em blastmeros
embrionrios, tm a vantagem de estudar os
efeitos nos estgios iniciais de desenvolvimento,
quando os processos de morfognese esto
moldando o embrio e associar diretamente o
frmaco com o efeito observado, evitando as
possveis variaes do ambiente e a interferncia
de outros componentes.

Discusso
O enfoque estratgico desse estudo no

ecotoxicolgico, mas trata com marcadores

moleculares e outras tcnicas, a investigao
dos mecanismos celulares prprios do
desenvolvimento embrionrio normal, que
puderam estar envolvidos em sua alterao.

Discusso
Portanto trata de independentes observaes

experimentais
das
variaes
do
meio
ambiente e das conhecidas diferentes
sensibilidades prprias de cada espcie em
seu
meio
natural
(Ph,
temperatura,
concentraes
variadas
e
diferentes
mecanismos de absoro e excreo).