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CROMATOGRAFIA
A Cromatografia uma tcnica analtica onde os
componentes a serem separados so distribudos entre uma
fase mvel e uma fase estacionria.
CLASSIFICAO DOS MTODOS CROMATOGRFICOS
Cromatografia
Planar
Coluna
Gasosa
Lquida
Camada
delgada
Papel
ESQUEMA DE UM EQUIPAMENTO DE GC
5
3
1
split
splitless
3)
gs
gs
gs
DETECTOR
3)
Coluna:
3) Coluna:
Tipos de coluna:
- Empacotada
- Capilar
Em colunas capilares temos uma maior eficincia,
uma melhor resoluo cromatogrfica e um tempo
de anlise menor.
3) Coluna:
Eficincia da coluna pode ser calculada pelo nmero de pratos
tericos (N):
N = 16 (TR / Wb)2 = 5,545 (TR / Wh) 2
TR
= tempo de
reteno
Wb = largura da base
do pico
Wh = largura a meia
altura do pico
Um prato terico definido como sendo um equilbrio de
distribuio do soluto entre as duas fases; quanto maior o
valor de N, mais equilbrios existiro e a separao ser
maximizada.
3) Coluna:
Os parmetros operacionais de uma coluna podem ser
melhor avaliados por seu efeito sobre a altura equivalente a
um prato terico (AEPT ou H)que corresponde razo entre o
comprimento da coluna, L (em cm) e o nmero de pratos
tericos, N.
H = AEPT = L /N
Portanto, H o comprimento necessrio de uma coluna para
gerar um prato terico; quanto maior N, menor ser H e mais
eficiente ser a coluna.
3) Coluna:
Resoluo:
A Resoluo (R) uma medida quantitativa da
separao de dois picos consecutivos, sendo determinada
por dois fatores: TR e Wb.
R = 2 TR / Wb1 + Wb2
3) Coluna:
Resoluo:
4) Forno:
-Temperatura
-Anlise isotrmica: quando a anlise em cromatografia em fase gasosa realizada com forco mantido temperatura constante desde o incio
at o final.
-Temperatura programada: a temperatura muda durante o decorrer da anlise
4) Forno:
4) Forno:
5) Detectores:
A) Detector de Ionizao de Chama (FID)
B) Detector de Condutividade Trmica (TCD)
C) Detector de Nitrognio-Fsforo (NPD)
D) Detector de Captura de Eltrons (ECD)
Obs: Em geral utiliza-se temperaturas mais elevadas no detector do que no forno, para evitar condensao de substncias no detector (contaminao).
5) Detectores:
A) Detector de Ionizao de Chama (FID)
-ons so gerados na chama e detectados.
-Detecta substncias ionizveis em chama (hidrocarbonetos)
FID:
Detector
resistente,
robusto.
5) Detectores:
B) Detector de Condutividade Trmica (TCD)
Princpio: A velocidade de perda de calor de um corpo quente depende dos gases presentes na regio.
-Apresenta resposta a todos os compostos, universal.
-Detector simples, baixo custo e boa estabilidade.
corrente eltrica
filamento
Referncia
Gs de arraste
5) Detectores:
C) Detector de Nitrognio-Fsforo (NPD)
O detector de nitrognio-fsforo utiliza um sistema similar ao FID. Entretanto ele utiliza uma pequena prola de rubdio (elemento ativo) que eletricamente aquecido. Na presena dessa fonte termoinica, compostos que contm nitrognio ou fsforo na molcula so eficientemente ionizados. Os ons so coletados e a corrente eltrica medida.
-Dispendioso e de estabilidade regular,
-Altamente seletivo
-Excelente detector para compostos contendo nitrognio ou fsforo na molcula.
5) Detectores:
C) Detector por Captura de Eltrons (ECD)
O ECD tem seu funcionamento baseado na acaptura de eltrons pela substncia a ser detectada, eltrons estes gerados pela ionizao do gs de arraste por uma fonte radioativa.
elemento radioativo Ni 63- emite partculas
+ N2
N2+ + e- (so detectados por um anodo)
X + eX- + N2+
X + N2
-Insensvel a presena de hidrocarbonetos, lcoois e cetonas.
-Sensvel para compostos clorados, bromados (halognios), compostos organometlicos.
Impressora (integrador)
-fcil de operar
-preo moderado
Computador (workstation)
-mais caro
-mais flexvel, poderoso.
ANLISE QUALITATIVA
A identificao de substncias por cromatografia em
fase gasosa se d atravs do tempo de reteno (TR)
da substncia na coluna cromatogrfica comparada
com padres.
Injeo de amostra
Injeo de padro
ANLISE QUANTITATIVA
A quantidade de analito (substncia) proporcional
rea ou a altura do pico correspondente.
1 ng de substncia
2 ng de substncia
ANLISE QUANTITATIVA
Para se calcular a concentrao de uma substncia em uma amostra necessrio se fazer uma curva de calibrao.
Duas formas:
A) Mtodo do padro externo
B) Mtodo do padro interno
ANLISE QUANTITATIVA
A) Padro externo
Faz-se uma curva com vrias concentraes do analito. A seguir injeta-se o extrato da amostra
cuja concentrao se quer determinar e lana-se no grfico as reas obtidas dos picos contra as
concentraes dos adicionados.
ANLISE QUANTITATIVA
B) Padro Interno (PI)
O padro interno (PI) um composto que se adiciona amostra, antes de qualquer manipulao (extrao) de forma que no interfira com a anlise. O PI tem a funo de corrigir possveis imprecises durante a manipulao da amostra (fase de extrao, injeo da amostra) ou
mesmo variaes no equipamento de GC.
O PI tambm tem a funo de monitorar possveis erros de operao ou procedimentos durante a anlise.
O PI deve ter preferencialmente as seguintes caractersticas:
a) nunca ser encontrado na amostra;
b) ser disponvel em elevado grau de pureza;
c) ser bem resolvido dos outros picos;
d) ser estruturalmente semelhante ao analito, ou possuir os mesmos grupos qumicos do analito.
ANLISE QUANTITATIVA
B) Padro Interno (PI)
Exemplos:
CH3
N
CH3
O CH3
C O CH CH3
O
C O CH3
O
O
Cocana
2
CH3
Etanol
Isopropilbenzoilecgonina (PI)
CH2
OH
CH3
CH2
Propanol (PI)
CH2
OH
Obs:
Para anlise qualitativa, tambm importante a presena do padro interno, pois os tempos de reteno (TR) podem variar de uma injeo para
outra, devido s variaes no prprio equipamento. Desta forma, para identificao da substncia, utiliza-se o tempo de reteno relativo (TRR)
que o tempo de reteno do analito dividido pelo tempo de reteno do padro interno. Esse valor est menos sujeito variaes.
TR PI
TR X
PI
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3) Fase mvel:
A fase mvel deve ser desgaseificada para remover gases
dissolvidos que poderiam causar interferncias. Utiliza-se
ultra-som e bombas de vcuo. Tambm deve ser filtrada para
evitar entupimento da coluna cromatogrfica.
Podem ser utilizados dois tipos de eluio:
-isocrtica: quando se mantm a composio da fase mvel
constante durante toda a anlise cromatogrfica.
-programao de gradiente: quando altera-se a composio da
fase mvel durante a execuo da anlise. Utiliza-se dois ou
mais solventes com polaridades diferentes
4) Coluna cromatogrfica:
- Fase normal:
Fase estacionria polar (ex. trietilenoglicol)
Fase mvel relativamente apolar (Ex. hexano, ter isoproplico)
O componente menos polar eludo primeiro,
Aumentando-se a polaridade da Fase mvel, o tempo de eluio diminui.
-Fase reversa
Fase estacionria no polar (Ex. hidrocarbonetos)
Fase mvel relativamente polar (gua, metanol, acetonitrila)
O componente mais polar eludo primeiro,
Aumentando-se a polaridade da fase mvel, o tempo de eluio aumenta.
Obs. A maioria das separaes por HPLC so de fase reversa com empacotamentos
ligados de C8 ou C18 siloxanos.
5) Detectores:
A) Detectores UV/Vis
B) Detectores de fluorescncia
C) Detectores por ndice de refrao
D) Detectores eletroqumicos
5) Detectores:
A) Detectores UV/Vis
Os fotmetros UV foram os detectores mais empregados em HPLC. Eles medem as variaes na absorbncia na luz na regio de 190 a 350nm durante a passagem do efluente da coluna
na clula de fluxo. O mesmo projeto de detector, com poucas variveis permite a leitura na regio do visvel (350 a 700nm), onde, porm, a sensibilidade bem menor.
Devido a algumas razes tcnicas envolvendo as lmpadas de UV empregadas, os primeiros detectores assumiam como comprimento de onda universal de 254nm.
Atualmente existem os detectores de rede de diodos (diode array detector-DAD) que praticamente permitem levantar o espectro da substncia durante a eluio.
5) Detectores:
B) Detectores de fluorescncia
Detectam substncias que emitem fluorescncia.
C) Detectores por ndice de refrao
Os detectores por ndice de refrao medem as mudanas do ndice de refrao do efluente das colunas.
um detector universal, no seletivo, no muito sensvel e por isso empregado quando os outros no respondem ao composto de interesse.
D) Detectores eletroqumicos
Os detectores eletroqumicos se baseiam na possibilidade de muitos compostos serem oxidados ou reduzidos quando estiverem na presena de um potencial eltrico.
Referncias
CIOLA, R. Fundamentos de cromatografia a lquido de alto
desempenho HPLC. So paulo: Ed. Edgard Blcher, 1998.
LANAS, F. Cromatografia Em Fase Gasosa. Ed. So Carlos: ACTA,
1993.
YONAMINE, M. Apresentao oral: aula expositiva. So Paulo, ago.
2004, abr. 2005.