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ANALISIS DE LA PRESENCIA DE

ORGANISMOS GENETICAMENTE
MODIFICADOS EN MUESTRAS DE
ALIMENTOS
EXTRACCION Y PURIFICACION DE ADN
METODO DE EXTRACCION Y PURIFICACION
CON CTAB

I.B.Q. NORBERTO DANIEL VAZQUEZ TINAJERO

Mtodo del Bromuro de CetilTrimetil Amonio (CTAB)


El protocolo del (CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980. El
mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos
derivados de vegetales y est especialmente indicado para eliminar los
polisacridos y los compuestos polifenlicos, que, de otro modo, alteraran la
pureza del ADN y, por tanto, su calidad.
Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en gentica molecular de los
vegetales y ha sido probado en ensayos de validacin para detectar OGM (Lipp
et al., 1999; 2001).
Se han elaborado algunas variantes adicionales para adaptar el mtodo a una
amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin transformar
(Hupfer et al., 1998; Hotzel et al., 1999; Meyer et al., 1997; Poms et al., 2001).

Mtodo del Bromuro de CetilTrimetil Amonio (CTAB)


Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico
bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB), que forma un
complejo insoluble con los cidos nucleicos en medio hiposalino.
De ese modo, los polisacridos, los compuestos fenlicos y los
dems contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden
eliminarse por lavado.
El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentracin
salina y se precipita con etanol o isopropanol.

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)


Practica
Instrumental
Instrumental reductor (hoja de

bistur estril, mortero, etc.)


Bao mara o calentador
Microcentrifuga
Micropipetas
Mezclador de torbellino
Tubos para microcentrifuga de
1,5 ml
.

Bandejas de pesar o equivalente


Esptulas
Balanza capaz de efectuar mediciones
de 0,01 g
Asas
Soporte para tubos de microcentrifuga
Optativo: desecador en vaco para secar
los sedimentos de ADN

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)


Practica
Reactivos
Bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB)
N CAS 124-03-8
Cloroformo
Isopropanol
Na2EDTA N CAS 6381-92-6

Etanol
NaCl
Proteinasa K
Ribonucleasa A
Trometamol (Tris-HCl)
Agua desionizada esterilizada

Tampn a base de CTAB

CTAB 20 g/l
NaCl 1,4 M
Tris-HCl 0,1 M
Na2EDTA 20 mM

4g
16,4
g
3,15
g
1,5 g

Aadir 100 ml de agua desionizada;


ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M;
completar hasta 200 ml y esterilizar en
autoclave;
conservar el Tampon a 4C (seis meses
como mximo).

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)


Practica
Solucin de precipitacin a base de CTAB
CTAB 5 g/l
NaCl 0,04 M

1g
0,5
g

Aadir 100 ml de agua desionizada;


ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M;
completar hasta 200 ml y esterilizar en
autoclave;
conservar la solucin a 4C (seis
meses como mximo).

NaCl 1,2 M

Disolver 7,0 g de NaCl en 100 ml de agua desionizada;

esterilizar en autoclave y conservar a temperatura ambiente.

Solucin de etanol al 70 % (v/v)

Mezclar 70 ml de etanol puro y 30 ml de agua desionizada estril.

Ribonucleasa A 10 GM/ml: conservar a 20C.


Endopeptidasa K 20 GM/ml: conservar a 20C.

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)


Practica

Procedimiento

Debe efectuarse en condiciones estriles. La


contaminacin durante la preparacin de la
muestra puede evitarse empleando material
desechable y soluciones de descontaminacin
y evitando la formacin de polvo.

Depositar 100 GM de muestra


homognea en un tubo estril de 1,5 ml
para microcentrfuga;

aadir 300 l de agua desionizada estril


y mezclar con un asa;

aadir 500 l de tampn a base de CTAB


y mezclar con un asa;

aadir 20 l de proteinasa K (20 GM/ml),


agitar e incubar a 65C durante 30-90
minutos*;

aadir 20 l de ribonucleasa A (10


GM/ml), agitar e incubar a 65C durante
5-10 minutos*;

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)


Practica
centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g
aproximadamente;

trasladar el sobrenadante a un tubo de


microcentrifugacin que contenga 500 l de
cloroformo y agitar durante 30 segundos;

centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g


hasta que se separen las fases;

trasladar 500 l de la capa superior a otro


tubo de microcentrifugacin que contenga
500 l de cloroformo y agitar;

centrifugar durante 5 minutos a 16 000 g;

trasladar la capa superior a otro tubo


de microcentrifugacin;

aadir 2 volmenes de solucin de precipitacin a


base de CTAB y mezclar pipeteando;
incubar durante 60 minutos a temperatura
ambiente;

centrifugar durante 5 minutos a 16 000 g;


desechar el sobrenadante;
disolver el precipitado en 350 l NaCl (1,2 M);

aadir 350 l de cloroformo y agitar durante 30


segundos;
centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta
que se separen las fases;

trasladar la capa superior a otro tubo de


microcentrifugacin;

aadir 0,6 volmenes de isopropanol y agitar;


centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g;

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)


Practica
desechar el sobrenadante;
aadir 500 l de solucin de
etanol al 70 % y agitar con
cuidado;
centrifugar durante 10 minutos a
16 000 g;
desechar el sobrenadante;
secar los sedimentos y volver a
disolver el ADN en 100 l de agua
desionizada estril.

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