Conceitos Prvios

O que DNA?
Aonde se localiza o DNA numa clula ?
Do que so formadas as membranas celulares ?
Qual a estrutura do DNA?

 DNA determina as caractersticas de todos os seres

vivos.
DNA composto de um alfabeto de 4-letras
(nucleotdeo/ molcula) referido como A, T, C, and G.
A ordem do alfabeto determina as caractersticas
do organismos, como as letras de nosso alfabeto
determinam as palavras.
Cada clula do corpo humano contm >3 BILHES de
letras.

A nica diferena entre

os organismos vivos a
quantidade e ordem do
alfabeto de DNA.

Ncleo
(DNA)

Cloroplasto
Mitocndria

Vacolo

Citoplasma
Parede celular
Membrana celular

Componentes do DNA
DNA um polmero, sendo os monmeros os nucleotdeos,
chamado ento de polinucleotdeo.
Cada nucleotdeo consiste de um acar de 5 carbonos
(desoxiribose), uma base nitrogenada ligada ao acar e um
grupo fosfato.
Quatro nucleotdeos, que diferem somente na base
nitrogenada.
A = adenina
G = guanina
C = citosina
T = timina

Definies

A combinao de uma desoxirribose e uma base

constitueumdesoxinucleosdeo.
Acombinaodeumfosfato,deumadesoxirribose
eumabaseconstitueumdesoxinucleotdeo.

Adenina e Guanina so Purinas.

As Purinas so as maiores bases.

9tomoscada

http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIF

Timina e Citosina so chamadas Pirimidinas.

6tomoscada

http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIF

A Hidroxila do carbono-3 da pentose do primeiro

nucleotdeo se liga ao grupo fosfato ligado hidroxila do
carbono-5 da pentose do segundo nucleotdeo atravs de
uma ligao fosfodister (ligao covalente)

http://www.universitario.com.br/celo/topicos/subtopicos/genetica/dna/Image27.gif

Com base na estrutura de dupla hlice do DNA e nas

caractersticas de hidrofobicidade das molculas, a estrutura
do DNA fica da seguinte forma:
O grupo fosfato e o acar (parte hidroflica)
esto localizados na parte externa da molcula.
As bases nitrogenadas (parte hidrofbica)
esto localizadas na parte interna da molcula.

Primeiro rascunho do Francis

Crick da estrutura do DNA

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/c/c8/FirstSketchOfDNADoubleHelix.jpg

Pontos importantes
Por conveno, um polinucleotdeo lido da extremidade
5para a 3.
As orientaes das duas fitas antipararela: suas
direes 5' - 3' so opostas.
As duas fitas so mantidas unidas pela energia de
muitas pontes de hidrognio (A=T e G=C) e interaes
hidrofbicas.

http://www.johnkyrk.com/DNAanatomy.html

Extrao e Quantificao

cidos Nucleicos

DNA na minha comida???

DNA na minha comida???

CURIOSIDADE:
Cada clula contm cerca de 3 metros de
DNA.
Refeio = 55.000.000 clulas ou
Cerca de 150.000 km de DNA.

DNA na minha comida???

DNA est presente nas clulas de todos os organismos

vivos.
O processo de extrao de DNA de uma clula o
primeiro passo em vrios procedimentos de um
laboratrio.
Deve-se separar o DNA de substncias indesejveis da
clula, gentilmente, para que o DNA no se desnature
(quebre).

Introduo

DNA na minha comida ???

Pode-se extrair o DNA, preparando-se uma
soluo de banana tratada com sal, gua
destilada, e shampoo (detergente) .
O detergente quebra a membrana celular,
dissolvendo os lipdeos (molculas de gordura) e
protenas da clula, alm de quebrar as ligaes
que mantm a membrana celular intacta.

Introduo

DNA in minha comida ???

O detergente forma ento um complexo
com os lpdeos e protenas, permitindo
que sejam filtrados para fora da soluo
com um filtro de caf.
O DNA das clulas ficam no filtrado.
O sal permite que o DNA precipite com a
adio de lcool (ons Mg e Cl).
Introduo

DNA na minha comida???

Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Passo 1

Em um liquidificador,
misturar uma banana
com um copo de gua
destilada (250ml).

Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Passo 1 (cont.)

Bater por for 1520 segundos, at a

soluo virar uma
mistura.

Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Passo 2

Num copinho de
caf, fazer uma
soluo contendo
1 colher de ch de
shampoo ou
detergente e 2
pitadas de sal de
cozinha.
Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Passo 2 (cont.)
Adicionar 20 ml (4
colheres de ch) de
gua destilada.
Dissolver o sal e o
shampoo/ detergente
mexendo devagar para
evitar fazer espuma.
Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Passo 3
soluo do passo
2, adicionar 3
colheres cheias da
soluo de banana
do passo 1.
Misturar a soluo
com a colher por 510 minutos.
Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Passo 4
Enquanto uma pessoa
mistura a soluo de
banana, outra coloca um
pedao (cone) de filtro de
caf dentro do outro copo
de plstico. Dobre as abas
do filtro para fora para
que no encoste no fundo
do copo.

Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Passo 5
Filtre a mistura no
filtro e deixe a
soluo drenar por
vrios minutos at ter
cerca de 5 ml
(cobrindo o fundo do
copo) do filtrado para
testar.

Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Passo 6

Pegar um tudo com

lcool gelado. Para
melhores
resultados, o lcool
deve estar o mais
gelado possvel.

Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Passo 7

Encher a pipeta de
plstico com a
soluo de banana.

Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Passo 8

Adicionar a
soluo ao lcool.
Deixe descansar
por 2 a 3 minutos
sem mexer o
tubo. muito
importante no
agitar o tubo.
Extrao de DNA

DNA na minha comida???

Resultados

Voc pode assistir

o precitado branco
de DNA na camada
de lcool. O DNA
tem uma aparncia
de um muco
esbranquiado e
como se fosse uma
nuvem.
Extrao de DNA

ExtraocomFenol
Fenol usado para desnaturar e
remover protenas de solues que
contm cidos nuclicos.

1.

Homogeneizao do material (nitrognio lquido

ou banho de gelo seco e etanol), com tampo.

2.

Adicionar o mesmo volume de fenol amostra,

colocar no vortex ou agitar.

3.

Centrifugar para separar 2 fases (de fenol

embaixo e aquosa acima). Transferir fase aquosa
para novo tubo.
Repetir 2 e 3.

ExtraocomFenol(Cont.)
4. Repetir a extrao agora com 24:1 Clorofrmio: lcool
isoamlico. Centrifugar, recolher fase aquosa e repetir 4.

5. Adicionar 0,1 volume de NaOAc 3M + 1,8 volumes de

etanol 95% gelado, inverter tubo algumas vezes
(passo para livrar o DNA dos sais e concentrar o
DNA).
6. Se houver precipitao ou nuvem, centrifugar 5 a
10 min. Se no conseguir ver DNA, -20C 15 a o/n e
centrifugar. Retirar EtOH
7. Lavar precipitado com 70% etanol e centrifugar
8. Retirar etanol, secar ao ar e ressuspender em TE
ou ddH20 (50 a 500 l)

PontosImportantes
O fenol usado para remover protenas e outros
contaminantes da soluo aquosa do DNA.
O clorofrmio ajuda desnaturar protenas e a
remover o fenol residual.
O lcool isoamlico geralmente adicionado ao
clorofrmio para reduzir espuma.

ExtraoSimples
Material + Tampo de Lise: Tris, EDTA,
SDS, NaCl e proteinase K.
Digesto a 37 C (clulas, 2-3 hs) ou 55 C
(tecido, overnight) sob agitao.
Precipitao com isopropanol
Resgatar o precipitado (nuvem) e
ressupender em gua ou TE.

ExtraodeDNAplasmidial
Plasmdeos:pedaosdeDNA
extracromossmicos,
covalentementefechados;

Codificamgenesderesistncia
antibiticosoumetaispesados,produo
depigmentos,devirulncia,etc.
Tambmpossuemgenesparasuaprpriareplicao
120kbx~5000kbemE.coli,sendofcilaseparao
dosDNAs

ExtraodeDNAplasmidial
Depoisdecresceroplasmdeorecombinanteembactria,temos
quenoslivrardosoutroscomponentesdasclulasbacterianas
(membranas,paredecelular,ribossomos,RNAeDNA
cromossomal
CentrifugarculturaeressuspenderpelletemtampoTrisEDTA
(queligadivalentementeactionsCaeMgecomistoajudaa
desestabilizaramembranadeE.coli).
EntoadicionamosumasoluocomNaOH(queaumenta
opHedesnaturaoDNAcromossomalenoodoplasmdeo)
eSDS(quevaisolubilizarasmembranasecausaralise
dasclulas).

ExtraodeDNAplasmidial
(cont.)
DecrescemosopHcomacetatodepotssio(oDNAcromossomalno
poderavoltarasuaestruturaoriginalesairdesoluo)
Aocentrifugarmos,oDNAcromossomalprecipitareoplasmidial
ficaremsoluojuntocomprotenasesais.
PurificaroDNAcomextraocomfenoleclorofrmio,seguido
deprecipitaocometanoloucomumamembranadeslicagel
(oDNAvaiseligarmembranasobaltasconcentraesdesais
esedesligarcomareduodaconcentraodesais,aocontrrio
dasprotenasesaisquepassarodireto.Apslavagemcometanol
paralavarossaisoDNApodesereludo
ODNApodeselivrardoRNApelotratamentocomRNAseA

ExtraodeRNA
Envolve desnaturante forte para quebrar clulas,
solubilizar seus componentes e desnaturar
RNAses endgenas simultaneamente.
Envolve lise das clulas, desnaturao das
protenas da membrana celular e depois os passos
normais como em DNA
Soluo Desnaturante:
Tiocianato de Guanidina 4M
Citrato de Sdio 25 mM
0.5% Sarcosil
Beta-Mercaptoetanol 0.1 M

ExtraodeRNAm
1,5 a 5% do RNA celular
Usada para RNAm raros, para fazer sondas
ou para bibliotecas de cDNA.
Eucariotos:usasecolunasdeceluloseeoligodT
oumagneticbeadseoligodT(umacadeia
sintticade2030timinas)

Jpossvelparaprocariotos

ORNAestINTACTO???
Geldeagarose
desnaturante:para
desfazeraestrutura
secundriadoRNA

Quantificao
Paraqu:
SintetizarcDNAparaproduodebiblioteca
PurificaodefragmentosdeDNApara
subclonagem
Quantificaodeprodutosamplificados
DetecodemolculasdeDNAempreparaes
dedrogas.

Quantificao
Quantificao
MaisusadacomEspectrofotmetro
A260destimativadaconcentrao
Leituradaabsorbnciaa260e280nm
OD260=1.0,dsDNA=50g/mL;
RNA=40g/mL
Desvantagens:interfernciacommaterialpara
extrao,inabilidadedediferenciarentreDNAe
RNA,sensibilidade:50250ngDNA/mL
RNAepH(>7,5):pHcidoafetaaabsorocom
A260,ajustarcomNa2HPO4(conc.finalde1mM)

Comofazer
Reagentes e Equipamento
Espectrofotmetro UV, cubetas de quartzo, ddH20
1 ZeraroaparelhocomddH20
2 Diluirumvolumeconhecidodecidonucleico
emgua.
3 RealizaraleituraemOD260eOD280.
4 Calcularaconcentrao.

Clculos
DNA[](g/L)=

OD260

xF.D.x50(g/mL)
1000

F.D.=fatordediluio

Ex.:3ldeDNA+97lH20;OD260=0,0157
DNA[]=0,0157x33,33x50/1000=26,16ng/l

Pureza
DNA: Razo A260/A280 >= 1,75 - 1,80
< 1,75 contaminao com lipdeos ou protenas
RNA: Razo A260/A280 ~ 2,0
< 2,0 contaminao com guanidina (da extrao)
> 2,0 contaminao com fenol ou clorofrmio

OUTROSMTODOS
Fluormetro:utilizamaterialfluorescente
queseligaaocidonuclicosem
problemascomprotenas(picoGreen;
sondasdecianina).SeletivosparadsDNA.
Vantagemmaiorasensibilidade:0,5ng/
mL(100a1000vezesmaiorqueo
espectrofotmetro)

OUTROSMTODOS
Geldeagarose:
aplicandoseas
amostrasdeDNA
juntamentecom
padresde
concentrao
conhecida

100a300ngdeplasmdeo

Pormeiode
corridajunto
aummarcador
deDNA

http://www.neb.com/nebecomm/productfiles/778/images/N3231.gif

cidosNuclicos
EstabilidadeDNAversusRNA
Nucleases
Cuidados:autoclavagemdemateriaise
tampes;estocagem(DNAeRNA).
TE (10 mM tris-HCl, pH 8,1, 1 mM EDTA) x
nucleases e DEPC x RNAses

ArmazenagemdeDNAeRNA
DNA: 4C (em TE) ou - 20C (maior tempo)

RNA: manter sempre no gelo quando manipulado e

a - 70C (maior tempo)

PontosImportantes
Maioria das nucleases precisam de Mg para
atividade, o EDTA ajuda na inativao delas.
RNA normalmente armazenado em ddH20 que
foi previamente tratada com DEPC (0,1%) para
inativar as RNAses.
Muitas RNAses sobrevivem autoclavagem ento
DEPC deve ser usado tambm para solues.
Importante inativar DEPC antes de usar pois pode
modificar o RNA e inativar enzimas (RT e
quinases)
DEPC altamente txico para humanos !!!
DEPC incompatvel com TRIS !!!

ANIMAO
http://gslc.genetics.utah.edu/units/biotech/ex
traction/

ANIMAO
http://www.jove.com/Details.htm?ID=24
6&VID=238