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BIO10-329 Biofsica de Protenas

Regente: Clia R. Carlini

Estratgias para purificao de uma protena


Os assuntos abordados nessa aula so:
- Mtodos de centrifugao e precipitao diferencial
- Dosagem de protenas
- Mtodos cromatogrficos
- Anlise de eficincia da purificao
Ateno ! Use o modo apresentao de slides para ativar as animaes

Principais componentes moleculares da bactria E. coli


Componentes
H2O
Protenas
Ac. Nuclico
Carbohidratos
Lipdeos
Outros

N de molculas diferentes
1
3.000
1 - DNA e 1000-RNA
50
40
ons - 12
Mol. Monomricas - 500

% peso total
70
15
7
3
2
3

A tabela acima mostra a percentagem em peso dos principais tipos de


molculas presentes em uma clula simples, a bactria Escherichia coli.
Observe que as protenas compem o grupo mais diverso de molculas.
Como so as protenas que executam a maior parte das funes vitais de
um organismo, uma grande parte das questes na Biologia envolve conhecer
em detalhes a estrutura 3D e o funcionamento de uma protena.
Para se obter uma protena em particular, necessrio separ-la de
todas as outras que esto presentes na mesma fonte biolgica.

Mtodos de Isolamento de Biomolculas


O isolamento ou purificao de uma protena uma etapa que precede
os estudos de suas caractersticas fsico-qumicas, de sua estrutura 3D
e a compreenso de suas propriedades biolgicas.
Inicialmente, a estratgia de purificao de uma protena emprica, ou
seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada
protena individualmente. No h como prever quais mtodos sero os
mais eficientes para se purificar uma protena pela primeira vez.

Mtodos de
purificao

Protenas de uma clula

1 protena
isolada

Mtodos de Isolamento de Biomolculas


Existe uma grande variedade de mtodos visando a separao de biomolculas.
Como na maioria das vezes o que se pretende purificar uma protena, o grupo
de molculas com maior diversidade, as metodologias de separao de protenas
tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opes disponveis.
Os mtodos de separao de biomolculas so agrupados em duas categorias:
Mtodos baseados em caractersticas fsico-qumicas das biomolculas:
1. Tamanho Massa Densidade (ex: centrifugao, dilise, gel-filtrao)
2. Carga eltrica (ex: cromatografia de troca inica, eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)
Mtodos baseados em afinidade biolgica, que exploram a interao entre duas
molculas:
4. Cromatografia de afinidade (pressupe que uma das molculas do par que
interage um reagente de fcil obteno, disponvel comercialmente)

MATERIAL BIOLGICO DE PARTIDA: (100g)

SOBRENADANTE

ORGANELAS

Lisossomos
Lisossomos
Mitocndria
Mitocndria
Golgi
Golgi
Ncleo
Ncleo

Precipitao com
Sal/Solvente

F1

F2

F3 F4
Precipitao com
Sal/Solvente

F 2 .2

F 2 .1

F 2 .3

O fluxograma ao lado representa a


marcha de purificao de uma protena,
mostrando as etapas sucessivas, cada
uma consistindo de mtodo, que levam ao
isolamento de uma protena presente
numa mistura complexa.
Observe a quantidade de protenas
(100g) presente no material inicial e
quanto da protena purificada se obtm no
final (0,001g). Esses nmeros so tpicos
para a purificao da maioria das
protenas, em especial enzimas.

Cromatografia Troca Inica

F 2 .3.2

F 2 .3.1

. . . . . .

2. 3.N

Cromatografia Troca Inica


(pH ou resina diferente)

F 2 .3.N.X
Gel Filtrao

1 Protena apenas
(0.001g)

- 0.1 a 0.5% total

Em cada etapa, a protena de interesse


separada das demais com base em uma
propriedade diferente. Consequentemente, as protenas ainda misturadas com
aquela que est sendo isolada so cada
vez mais semelhantes em suas
caractersticas fsico-qumicas, exigindo
mtodos cada mais sensveis, capazes
de explorar pequenas diferenas, para se
chegar protena pura.

MATERIAL BIOLGICO DE PARTIDA: (100g)


Alm dos mtodos de purificao, anlises

SOBRENADANTE

ORGANELAS

Lisossomos
Lisossomos
complementares devem ser feitas ao longo da
Mitocndria
Mitocndria
purificao, para verificar se o processo de
Golgi
Golgi
separao est sendo eficiente.
Ncleo
Ncleo

Precipitao com
Sal/Solvente

F1

F2

F3 F4
Precipitao com
Sal/Solvente

F 2 .2

F 2 .1

F 2 .3

Cromatografia Troca Inica

F 2 .3.2

F 2 .3.1

. . . . . .

2. 3.N

Cromatografia Troca Inica


(pH ou resina diferente)

F 2 .3.N.X
Gel Filtrao

1 Protena apenas
(0.001g)

- 0.1 a 0.5% total

A medida da atividade biolgica da protena


de interesse e do contedo de protenas de
cada frao resultante do processo de
separao devem ser feitas a cada passo.
Assim, apenas a frao que contm a
protena de interesse, marcada com um
crculo vermelho no fluxograma, submetida
prxima etapa de purificao.
Medida da atividade biolgica
- particular para cada protena
- deve ser quantitativa, para estimar quanto
da protena de interesse h em cada frao.
Medidas do contedo proteico (diversos)
- absorbncia de luz UV de 280 nm
- mtodos colorimtricos
(ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)

Absortividade molar,

Mtodos para medida do contedo de protena:

Comprimento de onda

O grfico mostra o espectro de absoro de luz UV dos aminocidos aromticos Trp, Tyr ou Phe.
A absorbncia de uma soluo de protenas a 280 nm diretamente proporcional ao seu contedo
proteico, desde que essas contenham esses aminocidos na sua composio, especialmente
triptofano.
A vantagem desse mtodo que ele no destrutivo para a protena. Em geral, considera-se que uma
leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentrao de 1 mg/mL.

Mtodos para medida do contedo de protena:


Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato
Cu2+ reage com as ligaes peptdicas e produz um
complexo prpura com absoro mxima em 540 nm
1. Cu2+ quelado pela protena
[Cu2+-proteina]
2. Reao redox
Cu2+ + (ligaes peptdicas) > [Cu+ -protena]
Mtodo de Lowry
ons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presena de
protenas e cadeias laterais de aminocidos
aromticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o
reagente de Folin-Ciocalteu (cido fosfomobidnio-tungstnio), dando um composto
de cor azul.

Reagente Bradford
= Coomassie
Brilliant Blue G-250

Mtodo baseado em uma mudana espectral do


reagente, em que d absoro mxinma a 595 nm (cor
azul), quando interage com protenas.
Interao com protenas se d atravs de
foras de Van der Waals e ligaes inicas,
especialmente com arginina, mas tambm com
resduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e
fenlialanina.

BCA = cido 2,2'-Bicinchonnico ou


4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline
ons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presena de
protenas reagem fortemente com o BCA
formando um composto azul,

Para iniciar a purificao, inicialmente necessrio extrair a protena de interesse


para um meio lquido, exceto se ela j estiver naturalmente presente em um meio
lquido (sangue, suor, gua do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).

Material na
fonte

por ultra-som

com
detergente

Vrios mtodos so
possveis para transformar
clulas, rgos, tecidos em
um homogenado, ou extrato
bruto, como mostra a figura.

clulas
Homogeneizao
(para romper tecidos e clulas)

tecidos

por presso
(prensa francesa)

liquefao
(Potter)

Homogenado
ou
Extrato bruto

Material
de
partida

Sendo a protena de interesse


uma protena de membrana,
necessrio solubiliz-la. Para
esse fim so utilizados
detergentes, que dissolvem a
membrana plasmtica e
formam complexos solveis
com as protenas.
Detergentes podem ser
inicos e no inicos

detergente

micelas

Dependendo da concentrao

Protenas
integrais da
membrana

Complexos
no micelares

Detergentes inicos

Cetab
Cetyltrimethylammonium
bromide

SDS
Dodecil sulfato de
sdio

Detergentes
no inicos
Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)

Deoxicolato de sdio

Octilglicosdeo
(octyl-b-D-glucopyranoside)

A centrfuga
Cmara blindada

Amostra
sedimentando

rotor
ngulo
fixo

refrigerao

A centrifugao frequentemente uma das primeiras


etapas de purificao aplicado a um extrato bruto. Atravs
do movimento de rotao do rotor da centrfuga, uma fora
centrfuga aplicada amostra, separando seus componentes atravs de suas massas e/ou densidade, conforme
a tcnica.
Atravs de sucessivas etapas de centrifugao com
velocidades (rotaes por minuto, rpm) crescentes, podese obter diferentes fraes de um homogenado de clulas
ou tecidos.

centrifugao diferencial

vcuo
homogenado

clulas intactas
pedaos de membrana
ncleos

sangue centrifugado: separao de plasma e clulas

mitocndrias
lisossomos
ribossomos

frao
citoplasmtica

Fora centrfuga

Existem centrfugas para diferentes tipos de aplicaes,


dependendo da fora centrfuga que so capazes de gerar.

Relao entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a fora centrfuga (g)

Centrfuga
Clnica
1,200g por 15 minutos
separa plasma de
clulas sanguneas

Ultracentrfuga
(necessitam vcuo
para evitar atrito do ar,
alm de refrigerao)

R$ 3.000

US$ 70,000

Preo aproximado

200,000 g por 24
horas para separar
organelas menores
ou complexos
proteicos

A centrifugao em um
meio com gradiente de
densidade melhora a
eficincia da separao. As
partculas se deslocaro
atravs do gradiente at
encontrarem uma regio
com densidade equivalente
a sua, quando param de se
mover, formando bandas.

Centrifugao em gradiente de densidade


Soluces de sacarose com
densidades diferentes so
colocadas no tubo, uma
sobre a outra

Gradientes podem ser


utilizados para separar
diferentes tipos de clulas,
organelas, cidos
nuclicos, complexos
proteicos, etc.

Amostra colocada no
topo do gradiente
5% sacarose

20% sacarose

Baixa densidade
Mdia densidade
Alta densidade
centrifugao

Gradiente

separao de:

Ficoll-Hypaque
Sacarose
Cloreto de csio

leuccitos
mitocndrias
cidos nuclicos

As mais potentes ultracentrfugas atuais ainda no so capazes de sedimentar protenas.


Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitao fracionada de protenas
so utilizados como etapas preliminares de purificao. Uma das vantagens desses mtodos
o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.
A precipitao de protenas pode ser induzida por:
- adio de sais (Precipitao salina)
- adio de solventes
- variao de pH (Precipitao isoeltrica)
Salting-in X Salting-out

Solubilidade da hemoglobina (S/S)

NaCl

KCl

MgSO4

(NH4)2SO4
K2SO4

Concentrao do Sal,, Molar

O grfico ao lado ilustra o efeito de


diferentes sais sobre a solubilidade
da hemoglobina.
Em baixa concentrao salina, a
solubilidade das protenas aumenta,
pois os ons do sal ajudam a reforar
a camada de solvatao.
Em alta concentrao salina, a
solubilidade das protenas diminue
pois os ons do sal competem pelas
molculas de gua disponveis para
formar a sua prpria camada de
solvatao.
Sais com nions divalentes so mais
eficientes do que os monovalentes
na precipitao de protenas.

Sais se dissociam em soluo aquosa e competem com as protenas pela gua de solvatao.

Hemoglobina

Solubilidade, log

Albumina

Fibrinognio

Considere uma soluo com fibrinognio,


albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e
mioglobina e observe o grfico.

Mioglobina

Pseudoglobulina

Concentrao do Sal (NH4)2SO4,, Molar

Protenas apresentam diferente sensibilidade


para a precipitao salina.
- precipitam primeiro:
protenas maiores
protenas mais hidrofbicas

Usando o sal sulfato de amnio (NH4)2SO4,


pode-se purificar completamente o
fibrinognio a partir de uma mistura das 5
protenas, pois este precipita totalmente em
uma saturao de 2,8 M do sal.
Neste ponto, centrifuga-se a soluo e o
fibrinognio coletado como um precipitado.
Numa prxima etapa, adicionando-se mais
sal soluo at uma saturao de 7 M,
pode-se obter um novo precipitado contendo
albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
E teremos tambm purificada a mioglobina,
ainda em solvel na presena de 7M do sal,
e que ficou sozinha no sobrenadante.

possuem camadas de solvatao maiores


ou menos organizadas, mais fceis de pertubar.

Protenas tambm podem ser precipitadas com adio de solventes ao meio ou


quando colocadas em meio com pH prximo ao seu ponto isoeltrico.

Protena

P.I.

Pepsina

<1,0

Protenas colocadas em meio com pH igual ao seu PI


tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam
a camada de solvatao menos organizada.

Ovalbumina galinha

4,6

Albumina srica humana

4,9

Tropomiosina

5,1

Insulina bovina

5,4

Fibrinognio humano

5,8

Gama-globulina

6,6

Colgeno

6,6

gua

Mioglobina equina

7,0

Hemoglobina humana

7,1

Ribonuclease A bovina

7,8

Dimetilformamida
Metanol
Etanol
Acetona
Clorofrmio
Benzeno

Citocromo C equino

10,6

Histona bovina

10,8

Lisozima, galinha

11,0

Salmina, salmo

12,1

Ponto Isoeltrico de algumas Protenas

Solvente

Constante Momento
Dieltrica Dipolar
78.5
48.9
32.6
24.3
20.7
4.8
2.3

1.85
3.96
1.66
1.68
2.72
1.15
0.00

Solventes miscveis com a gua diminuem a constante


dieltrica do meio e desorganizam a camada de solvatao
das protenas.
Os mais utilizados so etanol e acetona.

Para obter as protenas precipitadas em soluo novamente,


necessrio reverter as condies que levaram precipitao.

Aos precipitados obtidos com sal ou


solvente, adiciona-se gua.

Membrana
de celofane

Ao precipitado obtido com variao


de pH, retornar ao pH original.

solvente

soluo a
ser dialisada

incio

final

Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a dilise.


-amostra colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros
tratados, que permite a passagem de molculas at 10,000 d.
- o saco contendo a amostra imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- aps vrias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente ter sido retirado.

MATERIAL BIOLGICO DE PARTIDA: (100g) At o momento, exploramos as


etapas iniciais de purificao de
protenas, como a centrifugao
Lisossomos
diferencial e precipitao
Mitocndria
SOBRENADANTE
ORGANELAS Golgi
fracionada.
Ncleo
Precipitao com
Sal/Solvente

F1

F2

F3 F4
Precipitao com
Sal/Solvente

F 2 .2

F 2 .1

F 2 .3

Cromatografia Troca Inica

F 2 .3.2

F 2 .3.1

. . . . . .

2. 3.N

Cromatografia Troca Inica


(pH ou resina diferente)

F 2 .3.N.X
Gel Filtrao

1 Protena apenas
(0.001g)

- 0.1 a 0.5% total

Esses mtodos, apesar de terem


baixo poder de resoluo (exploram
diferenas grosseiras entre as
protenas), permitem processar
grandes volumes ou massas, tpicos
das etapas iniciais de isolamento.
Quando j houve reduo significativa dos montantes de protenas a
serem processados, iniciam-se as
cromatografias, que iro explorar as
diferenas mais sutis entre as
molculas.
No esquecer que todas as fraes
obtidas devem ter o contedo de
protenas e de atividade biolgica
medidos, para se decidir qual/quais
devero passar para o passo
seguinte da purificao.

Funcionamento Bsico de uma Coluna Cromatogrfica


Uma coluna um tubo cilindrco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou
matriz ou gel cromatogrfico. A coluna constantemente alimentada com lquido (tampo),
banhando a resina e forando o contacto desta e as molculas que esto sendo analisadas.
Abaixo est representado o esquema geral de uma cromatografia:

Amostra com
diferentes
componentes
Resina
embebida
em
tampo

Mais tampo
colocado na
coluna,
forando os
componentes
da amostra a
interagirem
com a resina

Os componentes da mistura so
separados por interao diferenciada
com a resina, com base em
propriedades moleculares como:
massa molecular
carga eltrica
solubilidade
afinidade

Tempo 2

Tempo 1

Lquido
que sae
da coluna

recolhido
em tubos
de um
coletor de
fraes

Componentes da
amostra se
separam e saem
da coluna com
diferentes
volumes de
tampo

Coletor de
fraes
Um cromatograma, como o
grfico ao lado, a maneira
usual de se representar o
resultado de uma
cromatografia.

Tempo n

Concentrao

Tempo zero

Tempo ou volume

Que caractersticas devem ter as resina cromatogrficas para possibilitar


separaes de molculas baseadas em diferentes propriedades ?

Cromatografia de permeao em gel ou gel-filtrao:


separao de molculas pela massa molecular
gis so porosos, funcionando como peneiras ou filtros
Cromatografia de troca inica:
separao de molculas pela carga eltrica
gis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente
Cromatografia de partio (fase reversa ou hidrofbica):
separao de molculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
gis possuem carcter hidrofbico
Cromatografia de afinidade:
separao de molculas pela capacidade de interagir com um ligante
gis possuem ligante especfico ligado covalente resina

Cromatografia de gel filtrao ou peneira molecular


Molculas com massas diferentes
protena grande
protena pequena

Fluxo do tampo
Tampo
empurra
molculas
atravs da
resina

gro da resina poroso

tubos

gros (beads) da
resina com poros

Na gel-filtrao, as protenas que penetram nos poros da resina precisam diferentes


volumes de tampo para sarem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os
canais internos dos gros. Quanto maior o nmero de gros que cada molcula entrar durante o
percurso atravs da coluna, maior o volume necessrio para sua sada.
Protenas maiores que o dimetro dos poros no so separadas e saem da coluna com
pouco tampo, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos gros, tambm chamado de
volume morto (Vo).
Protenas menores que o dimetro dos poros no so separadas e saem da coluna com um
volume de tampo correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do prprio gel).

A cromatografia de gel-filtrao possibilita estimar a massa molecular de


uma protena em seu estado nativo

Para isso, necessrio calibrar a coluna com protenas de massa


molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibrao.
O volume de sada (eluio) de uma protena numa coluna de gelfiltrao proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.

Ler a massa
correspondente

Molculas
maiores

20
25

50
75
100
volumeKav
de eluio

125 mL

traado da medida de atividade


biolgica nas fraes

40

60

80

Medir o volume de eluio


da frao mais ativa.
Transportar para a curva de
calibraao.

100

Molculas
menores

120 mL
volume

Medida da ativ. biolgica

Massa molecular (kD)

Observa
ra
escala
log

Absorbncia a 280 nm

Curva de calibrao

Alm de purificar, por ser realizada em condies de pH, fora inica


e temperatura que preservam a atividade biolgica da protena, a
gel-filtrao fornece a Mr do seu estado nativo.

Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtrao, conforme o tipo


de molculas ou partculas a serem separadas
indica quais os tamanhos
das partculas que podem
entrar nos poros da resina e
serem fracionados. Acima ou
abaixo da faixa, no h
separao.

Resinas para Gel-Filtrao


NOME

TIPO

FAIXA DE RESOLUO
(kD)

Sephadex G-10
Sephadex G-25
Sephadex G-50
Sephadex G-100
Sephadex G-200

Dextrana
Dextrana
Dextrana
Dextrana
Dextrana

0.05 - 0.70
1-5
1 - 30
4 - 150
5 - 600

Bio-Gel P- 2
Bio-Gel P- 6
Bio-Gel P- 10
Bio-Gel P- 30
Bio-Gel P-100
Bio-Gel P-300

Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida

0.1 - 1.8
1-6
1.5 - 20
2.4 - 40
5 - 100
60 - 400

Sepharose 6B
Sepharose 4B
Sepharose 2B

Agarose
Agarose
Agarose

*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio

10 - 4.000
60 - 20.000
70 - 40.000
-Gel: Bio -Rad Laboratories

Molculas pequenas

Protenas

Molculas pequenas

Protenas

Clulas, partculas sub-celulares

Esta uma outra forma de representar a calibrao de uma coluna de


gel-filtrao.
O gel nessa coluna o
Sephadex G-200, cuja
faixa de resoluo de
protenas de 5.000 a
600.000 d.
Observe como protenas
nos extremos da faixa
de resoluo tendem a
sair da parte linear da
curva.

Para comparar calibraes com a mesma resina cromatogrfica em colunas de


dimenses diferentes utiliza-se o Kav, que proporcional ao log de Mr.

Kav = Ve-Vo
Vt-Vo

onde:

Ve volume de eluio de uma certa protena


Vt volume total da coluna
Vo volume morto da coluna, em que saem molculas com

Cromatografia de troca inica


A resina para cromatografia de troca inica apresenta carga eltrica, positiva ou
negativa, em uma ampla faixa de pH.

DEAE
Trocadora de nions

CM
Trocadora de ctions

Existem dois tipos bsicos: resinas trocadoras de nions (possuem carga positiva),
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de ctions (possuem
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

Cromatografia de troca inica

---

O grfico mostra que essas resinas mantm suas cargas em uma ampla
faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de
10, enquanto que o CM-celulose utilizado em pH acima de 4, condies
em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas esto carregados.

Como funciona a Cromatografia de Troca Inica


Adsoro
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catinica ou
trocadora de nions, como o DEAE-celulose):

A cromatografia de troca inica compreende duas etapas:


1)
2)

adsoro das protenas com carga contrria


resina, e sada da coluna das protenas com a
mesma carga;
eluio das protenas adsorvidas.

+
+
+
+
+
+
++

Molculas com a mesma carga,


ou sem carga, no interagem com a resina,
sendo as primeiras a sair da coluna

Eluio
Para a eluio, as condies de adsoro da coluna
(pH ou fora inica) so alteradas para neutralizar a
interao entre as protenas e a resina.
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da
concentrao do sal no tampo, pois alteraes
pH podem desnaturar protenas, levando-as a
precipitar dentro da coluna.

Na+Cl- +
de

+
+
+
+
+
+
++

Adio de sal ao tampo resulta em


competio entre os ons em soluo
e as molculas adsorvidas na resina.

Como funciona a Cromatografia de Troca Inica


O processo da cromatografia de troca inica depende da diferena de ponto isoeltrico
das protenas na amostra e das condies escolhidas de pH e de fora inica.
Ponto Isoeltrico de algumas Protenas
Protena

P.I.

Pepsina

<1,0

Ovalbumina galinha

4,6

Albumina srica humana

4,9

Tropomiosina

5,1

Insulina bovina

5,4

Fibrinognio humano

5,8

Gama-globulina

6,6

Colgeno

6,6

Mioglobina equina

7,0

Hemoglobina humana

7,1

Ribonuclease A bovina

7,8

Citocromo C equino

10,6

Histona bovina

10,8

Lisozima, galinha

11,0

Salmina, salmo

12,1

Protenas apresentam carga positiva quando em meio


cido em relao ao seu PI, e carga negativa, quando em
meio alcalino em relao ao seu pI.
Nesse caso, a referncia para se dizer que o meio cido
ou bsico o PI da protena, e no o pH do meio.

H+
cido

PI

neutro

bsico

-COOH
+
-NH3

-COO

-NH2
H+

A carga das protenas varia em funo do pH do meio, pois o


pH influencia o estado de dissociao das cadeias laterais dos
aminocidos cidos e bsicos.

Responda: em pH 7,0, qual ser a carga


eltrica da albumina, da mioglobina e do
citocromo C ?

Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Inica


Gradientes de sal podem fracionar as protenas adsorvidas na resina de acordo
com a intensidade de suas cargas, que dada pela diferena entre seus PIs e o pH do
tampo de eluio.
As protenas no retidas (com a mesma carga da resina) no so separadas,
sendo simplesmente arrastadas pelo tampo (ou seja, no so repelidas pela resina).

Eluio NaCl

Eluio NaCl
+

0. 10 M

(-)

0. 15 M

++

CM

(-)
(-)

+
+ +

0. 20 M

0. 10 M

(+)

DEAE

(+)

0. 15 M

_
(+) =

0. 20 M

(+)

_
=

(-)

No retidas

Carboximetil~celulose
(trocadora de ctions)

+
+
+

No retidas

Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de nions)

Tipos de Resina de troca Inica


NOME
Dowex 1

TIPO

GRUPO IONIZVEL
OBSERVAES
Tipos
de
Resina
de
troca
Inica
Fortemente bsica
- CH N (CH )
Troca aninica

DEAE-celulose

resina de polistireno
Fortemente bsica
resina de polistireno
Bsica

CM-celulose

cida

DEAE -Sephadex

Gel de dextrano
bsico

CM - Sephadex

Gel de dextrano
cido

Dowex 50

3 3

- SO 3-H
Dietilaminoetil
- CH 2CH 2N+(C2H 5)2
Carboximetil
- CH2COOH
Dietilaminoetil
- CH 2CH 2N+(C2H 5)2
Carboximetil
- CH 2COOH

Troca Catinica
Fracionamento de protenas
cidas e neutras
Fracionamento de protenas
bsicas e neutras
Combinao de gel filtrao
e troca inica de protenas
cidas e neutras
Combinao de gel filtrao
e troca inica de protenas
bsicas e neutras

* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio


- Gel: Bio Rad Laboratories

Existem vrios tipos de resinas de troca inica disponveis no mercado.

Cromatografia de afinidade:
Um dos mtodos mais
eficientes para a
purificao de protenas,
possibilitando um alto
rendimento com nmero
reduzido de etapas.
A separao de
molculas tem como
base a interao
especfica do analito
(molcula-alvo) com um
ligante imobilizado na
matriz. Foras
envolvidas nessa
interao podem ser no
covalentes
(eletrostticas,
hidrofbica, pontes de H)
ou covalentes (p.e.,
ponte dissulfeto).

Ex: cromatografia de imunoafinidade


Adsoro
Mistura de protenas
Eluio
Partculas de
gel recobertas
de anticorpos
anti-A

Lavagem

pH 2,0 ou sal

Anti-A
interage
apenas
com a
protena A

Coluna
empacotada
com esse gel

Desprezar
protenas no
retidas

Complexo
Ag-AC
desfeito

Antgeno A
puro -

Eluio: condies que interferem na ligao da protena ao


ligante, como mudanas no pH e/ou fora inica, ou
por competio com o ligante livre

Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade


1. Mono-especficos - ligao especfica da molcula-alvo
- anlogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antignicos de anticorpos
- ligantes com tag ou marcao
- glutationa-S-transferase
- poli-Histidina
2. Grupo-especfico: ligantes para separao de grupos:
Ligante
grupo-especfico

Especificidade

Protena A

Regio Fc de IgG

Protena G

Regio Fc de IgG

Concanavalina A

Grupos glicosil- ou manosil-

Cibacron Blue

Vrias enzimas, albumina

lisina

Plasminognio, RNA ribossomal

arginina

proteinases tipo tripsina

benzamidina

proteinases tipo tripsina

calmodulina

Protenas reguladas por calmodulina

heparina

Fatores de coagulao, lipases,


hormnios, receptores estorides, etc

Metais de transio

Protenas e peptdeos com resduos


de His expostos

8-AEA-cAMP
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic
monophosphate
(ligante para protenas com afinidade por cAMP
ou cGMP)

Stios de ligao das


protenas A, G e L
imunoglobulina, que permitem
a purificao de anticorpos por
cromatografia de afinidade

Preparo da resina de afinidade:

Estratgias para acoplamento de ligantes resina


Reagente
Alvo no ligante

Passo 1. Ativao da resina


Passo 2. Acoplar
o ligante

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) h o risco de impedimento


estrico entre a matriz e a molcula-alvo, que causa dificuldade
ou impede sua ligao resina.
A introduo de um brao espaador (alguns C) diminue o
risco.
Brao espaador covalente entre
a resina e o ligante

Molcula-alvo (analito)
ligante
Ligao reversvel no covalente

Cromatografia de Partio
Princpio: Explora diferenas de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade
diferentes, um polar e outro apolar.
Aplicvel especialmente molculas pequenas, como compostos orgnicos, aminocidos, peptdeos,
acares, lipdeos, etc.
Apresenta limitaes para uso com protenas acima de 20-30kda, que so desnaturadas em presena
de solvente orgnico.

Consiste de 2 sistemas:

Fase estacionria
(suporte slido)

Fase mvel
(lquido ou gs)

Duas Possibilidades

- Amostra se deslocar ( mais solvel) acompanhando a Fase Mvel


AMOSTRAS

- Amostra no se deslocar ( mais solvel) na Fase Estacionria


Dois tipos de montagem:

CROMATOGRAFIA DE PARTIO

CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA

Suporte: PAPEL

Suporte: GEL DE SLICA (camada delgada ou TLC)

Fase Estacionria: Aquosa (H20 na celulose)

Fase Estacionria: slica (mineral apolar)

Fase Mvel: Solvente orgnico (hidrofbico)

Fase Mvel: Solvente aquoso ou gua

Cromatografia de Partio
tempo 0
Papel
ou placa
de slica

t1

t2

tn
direo do
fluxo do
solvente

Amostra
na origem

Compostos
separados

Rf =

distncia de migrao da substncia


distncia de migrao do solvente

Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)

Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substncia apresenta um


valor de Rf caracterstico.
Assim, alm de um mtodo de purificao, as cromatografias de partio permitem
identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas aps a separao)
diferentes compostos.
Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da slica e recuperar o
composto isolado.

HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography


Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia
abrange aplicaes para todos os tipos de cromatografias.
Caracterstica diferencial da cromatografia convencional:
partculas de resina com dimetro muito pequeno (poucos microns)
aumento da eficincia da separao em funo do nmero maior de gros
de resina em um mesmo volume da coluna
fase mvel - necessita bomba de alta presso para ter fluxo atravs da coluna
Desenho bsico de um HPLC

Detector
Controle e
anlise dos
dados

Duas bombas permitem eluio em gradiente


Detector: ndice de refrao, absorbncia UV
ou Vis, fluorescncia, etc.

bombas

Injetor de
amostra

Coluna e
forno

Coletor de
fraes

Coluna pode ser aquecida para melhorar a


eluio diferencial na fase reversa

Fase reversa: resinas de slica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C

Molculas
retidas

100

% de acetonitrila

Absorbncia a 214 nm

Molculas
no retidas

Tempo ou volume de reteno


Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluio por um gradiente de acetonitrila
Fase estacionria
C18
C8
tC2
Aminopropyl
Cyanopropyl
Diol
CN Fenil

Funo
Si (CH3)2 C18 H37
Si (CH3)2 C8 H17
Si C2 H5
Si (CH2)3 NH2
Si (CH3)2 (CH2)3CN
Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH

NH2 C4 C8

C18

Reteno na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia

Condio de equilbrio: em meio cido


(0.1% de cido trifluoroactico) para
aumentar hidrofobicidade (protonar as
carboxilas)
Eluio com gradiente crescente de solvente
orgnico miscvel com gua
- acetonitrila, metanol, propanol

Cromatografia de interao hidrofbica

Protenas em soluo salina concentrada


perdem parte da camada de solvatao para
os sais, expondo na superfcie regies ricas em
aminocidos apolares, que interagem com uma
matriz hidrofbica
Trs estratgias para eluio:
1. diminuir a concentrao de sal
2. diminuir a polaridade da fase mvel
3. adicionar detergente
Fora da interao hidrofbica aumenta com o
tamanho da cadeia de C na resina:

matriz
hidrofbica

Protena
altamente
hidroflica

Protena
menos
hidroflica

camada
de H2O
solvatao

[Protena]

um processo de partio que explora a interao entre aminocidos


apolares de uma protena e uma matriz de carcter hidrofbico.

Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8)


Eficincia dos sais em provocar salting-out varia com a srie de Hofmeister:
nions: PO4-2> SO4-3>CH3COO->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCNCtions:NH4+>Rb+>K+>Na+>Cs+>Li+>Mg+>Ca+>Ba+

[sal]

volume

Como se avalia se o processo de purificao de uma protena foi eficiente ?


Trs parmetros permitem avaliar a eficincia do processo de purificao de uma protena:
- Atividade especfica (AE): a razo entre a quantidade da protena de interesse, medida
atravs de sua atividade biolgica, e a quantidade total de protenas presentes
em cada etapa de purificao. Esse ndice aumenta ao longo da purificao.
- ndice de purificao: indica quantas vezes em relao ao material de partida a protena
de interesse foi concentrada. Calcula-se como a razo entre as atividades
especficas inicial (material de partida) e final (protena pura).
- Rendimento: indica quanto (em %) da protena de interesse ativa presente no material de
partida foi recuperado ao final da purificao. Um certo grau de perda
inerente do processo de purificao (em cada etapa s devem ser processadas as fraes mais ricas em atividade biolgica, desprezando-se aquelas
que apresentam pouca atividade).
Tambm podem ocorrer perdas por desnaturao das protenas devido s
diferentes condies (pH, sais, etc) a que so submetidas nas diferentes
etapas de purificao. Espera-se recuperar o mximo possvel da protena de
interesse.

Purificao da Glicoquinase heptica de Rato


b Rendimento
c
AtividadeEspecfica
ndiceb
.
a
-1
( U.mg
)
(
%
)
U
Purificao

Etapa
Marcha A: somente cromatografias convencionais

1. Sobrenadante
de pncreas
2. (NH4)2 SO4, precipitado 25
-55%
3. troca inica, coluna DEAE
-Sephadex, pH 7.0,eluioKCl
4. troca inica, coluna
CM-cellulose
, pH 5.5,eluioNaCl
6. interao hidrofbica, coluna
Butyl~Sepharose
7. gel-filtrao, coluna
SephacrylS-300

2.0
23
44
80
130

100
85
45
33
15
15

1
12
140

18
420

100
84
83

1
195
4.500

260
480
780

Marcha B: com cromatografia de afinidade

1. Sobrenadante
de pncreas
2. troca inica, coluna DEAE
- Sephadex
, pH 7.0,eluioKCl
3. Afinidade cromatogrfica
benzamidina~agarose
(
)
aU

nidade de enzima (1 unidade de atividade enzimtica definida como a quantidade de enzima que cataliza
a transformao de 1 micromol de substrato em produto, em condies pre-estabelecidas
b Atividade especfica: medida da atividade biolgica (em U) expressa por miligramas de protena
c Rendimento: percentual da atividade biolgica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificao
d ndice de Purificao : razo entre a atividade especfica inicial e aquela determinada em cada etapa.

Uma tabela como a vista acima a maneira usual de se descrever o resultado de uma
purificao. No exemplo acima, a mesma protena foi isolada por duas marchas diferentes de
purificao (A e B). Observe os parmetros de purificao.
Se voc fosse repetir essa purificao, qual esquema de purificao escolheria ?
EU TERIA ESCOLHIDO A MARCHA B.

Como se avalia se o processo de purificao de uma protena foi eficiente ?


A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composio de
protenas de uma amostra. um mtodo complementar para a purificao de protenas.
Fornece informaes sobre a massa molecular e composio
de subunidades da protena em meio desnaturante e redutor.
A poliacrilamida um polmero que um
gel de malha porosa.
A poliacrilamida funciona como uma
peneira, deixando passar atravs de seus
poros as molculas pequenas e retendo
as grandes

+
acrilamida

N,N-metilenobisacrilamida
Catalisador
(persulfato de amnio)

formado a partir da reao de acrilamida


e bisacrilamida.
concentrao de acrilamida variando de
5 a 20% determina o dimetro dos poros
uso de gradiente de acrilamida aumenta
o poder de resoluo
o gel polimerizado com tampo pH 8.9, na
presena do detergente Na+ dodecil sulfato (SDS)

poliacrilamida

Desnaturao de protenas por SDS


H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-

A poro hidrocarboneto do
detergente interage com as
regies hidrofbicas da protena,
dispondo o grupo sulfato
carregado na superfcie, em
contacto com o meio aquoso. A
repulso entre os grupos fosfato
desestabiliza os laos no
covalentes que mantm a
estrutura 3D da protena,
desnaturando-a.

Sdio dodecil sulfato

Efeito do SDS

desnaturao uniformiza a forma das protenas, que poderia influenciar na migrao atravs
dos poros da poliacrilamida;
mascara a carga natural das protenas no pH da corrida, fazendo com que todas molculas
migrem para o ando;
facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)

catodo

Poos para
as amostras

O desenho ao lado mostra o tipo mais comum


de cuba para PAGE.
Na cuba, o gel polimerizado entre duas
placas de vidro ou plstico, afastadas 1 mm
uma da outra.

amostra
1 mm

tampo
Placas
de vidro
gel
anodo
tampo

cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

Antes da polimerizao, um pente colocado


na parte superior do gel para formar os poos
onde sero colocados de 5 a 20 microlitros de
cada amostra, misturadas com azul de
bromofenol, um indicador da corrida.
As partes superior e inferior do gel fazem
contacto com recipientes de tampo, onde
esto os eletrodos que estabelecero o
campo eltrico (~100V) durante a corrida
(1 a 2h).
Terminada a corrida, as placas so retiradas
da cuba, e o gel entre elas cuidadosamente
retirado e corado para revelar as bandas de
protena. Como corantes utiliza-se Coomassie
Blue ou nitrato de prata.

Eletroforese em Meio Redutor

SDS-PAGE das protenas da bactria


Salmonella tiphymurium

Adio do redutor 2-mercaptoetanol rompe


pontes dissulfeto nas protenas, possibilitando a
determinao do nmero de cadeias e tipo de
ligao entre cadeias de protenas oligomricas

Direo
da
migrao

Padres

A
B

AB

ss

2 - Mercaptoetanol

A
B

SH

SH

Sem

Cada linha (banda) corada no gel


representa uma protena

Com

2 - Mercaptoetanol

Massa molecular (kD)

SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de protenas


A migrao eletrofortica, expressa como mobilidade relativa,
proporcional ao logaritmo da massa molecular. Utiliza-se protenas
padres com Mr conhecida para se fazer uma curva de calibrao
do gel em cada corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de
uma protena desconhecida na curva, pode-se estimar a sua
massa molecular.
Mr
(-)
Mobilidade relativa =

97.4
87.0

distncia percorrida pela banda X


distncia percorrida pelo marcador da corrida

45.0

29.0

Mobilidade relativa

(+)

21.0
12.5
6.5

Curva de calibrao de SDS-PAGE


Protenas padres em um SDS-PAGE

Terminamos aqui a 4.aula online do curso de Biofsica de Protenas.

Os assuntos abordados nessa aula so:


-

Mtodos de centrifugao e precipitao diferencial

Dosagem de protenas

Mtodos cromatogrficos

Anlise de eficincia da purificao

Na aula prtica, vocs tero oportunidade de ver alguns tipos de


cromatografia funcionando.