Gama de hospedeiros de

replicao de plasmdeos IncP1

intactos

Comparao da gama de hospedeiros de IncP1pKS208 e pMBUI1T17e de IncP-1pBP136

por ensaios conjugativos.
Ensaios de transformao: comparar
isoladamente as funes replicativas e a gama de
hospedeiros de replicao

Conjugao

Conjugao Materiais e
mtodos
1 ensaio: Pseudomonas putida como doadora
hospedeiro permissivo de plasmdeos IncP-1

2 ensaio: Escherichia coli como doadora

Cinco linhagens receptoras:
E. coli e P. putida: classe Gammaproteobacteria
Cupriavidus pinatubonensis: Betaproteobacteria
Agrobacterium tumefaciens e Sphingobium japonicum:
Alphaproteobacteria

Conjugao - Resultados
pKS208 no se auto-transferiu
No possui gene traC completo

Plasmdeo auxiliar pRK2013

Carrega genes para transferncia de IncP-1
Replicon ColE1 com genes RK2 conjugativos

Conjugao - Resultados
Plasmdeos IncP-1 e IncP-1

P. putida
P. putida
E. coli
P, putida

E. coli
C. pinatobunensis
C. pinatobunensis
S. japonicum , A. tumfaciens

IncP-1 X
IncP-1 pB136KM

E. coli

A. tumefaciens

IncP-1baixas frequncias
IncP-1 pB136KM: altas frequncias

E coli

S. japonicum

IncP-1X
IncP-ib PB136KM

Introduo

Conjugao - Concluso
IncP-1 e IncP-1tm gamas de hospedeiros
sobrepostas, mas diferentes;
A gama de hospedeiro aparente de IncP-1
limitada
Fraca transferncia doador
hospedeiro
Fraco estabelecimento no receptor

Transformao Materiais e
mtodos

Plasmdeos purificados de P. putida KT2440

quantificao do DNA feita por densitometria

Transformao por eletroporao

Eletroporao
A clula exposta a um campo eltrico
de alta intensidade, que desestabiliza
a membrana;
Formam-se poros na membrana,
permitindo a entrada do DNA exgeno
de interesse;
Quando o campo eltrico desligado,
a membrana se reestrutura, e o DNA
fica mantido no interior da clula.

Eletroporao
Procedimento no-qumico
No altera a estrutura biolgica ou
funo da clula;
Performance rpida e simples;
Grande eficincia;
Pode ser aplicada a diferentes tipos
celulares, desde que se ajuste os
parmetros eltricos;

Transformao Materiais e
mtodos
DNA doador: P. putida KT2440
Clulas transformadas
Preparao de clulas eletrocompetentes
Misturar com DNA plasmidial de interesse
Submeter mistura ao choque

Transformao Materiais e
mtodos
Plaqueamento pstransformao:
gar sem antibitico:
contagem das clulas
viveis
gar com antibitico:
contagem dos
tranformantes

Transformao - Resultados

Eficincias do estabelecimento dos plasmdeos IncP-1intactos nos cinco

hospedeiros.

Transformao - Concluso

Resultados consistentes com os obtidos no

experimento de conjugao
Atividade replicativa baixa em Alphaproteobacteria
Gama de hospedeiros dos plasmdeos IncP-1 se
sobrepe apenas parcialmente com a de IncP-1

Discusso Geral
No foi observada autotransferncia de IncP-1
pKS208 nos experimentos de conjugao
Delees no quadro de leitura em traC

pKS208 X IncP-1
Sequncias dos produtos gnicos
Contedo G+C dos operons tra e trb

Discusso Geral

Isolamento e caracterizao de novos IncP-1

Mais plasmdeos como pKS208
Determinao da base gentica de sua deficincia conjugativa