LA GENMICA Y SU APLICACIN A LA EXPLOTACIN DE LA

VARIABILIDAD NATURAL
En los ltimos aos se han completado las secuencias
genticas de organismos modelo, como la planta
Arabidopsis thaliana y el nematodo C. elegans, y otras
plantas de inters agrcola. por ejemplo, ya disponemos de
los genomas completos o parciales de avena, soja, cebada,
tomate, arroz, trigo y maz.
El conocimiento de la secuencia gentica completa o
genoma representa el primer paso para el conocimiento de
las funciones y mecanismos de actuacin de los genes. De
esta manera se revela las interacciones entre genes, que en
ltimo trmino pueden ser las responsables de la
caracterstica deseada.

La genmica se divide en dos grandes reas:

1. Genmica estructural, que se ocupa de la caracterizacin
fsica de genomas enteros.
2. GENMICA FUNCIONAL, que intenta averiguar el momento
(desarrollo embrionario, infancia, madurez o senescencia) y el
lugar (tejido, rgano) de expresin de un determinado gen y
ms tarde la funcin del mismo, estudiando las consecuencias
de la alteracin de ese gen (anulndolo o exaltando su funcin)
en un organismo mutado.
La Genmica funcional, caracteriza EL TRANSCRIPTOMA, que
est constitudo por el conjunto completo de transcriptos,
producidos por un organismo, EL PROTEOMA o conjunto de
protenas codificadas por un genoma, y EL METABOLOMA o
conjunto total de metabolitos de una clula, consecuencia de la
funcin de los RNA y protenas.

La estrategia de aplicacin de las herramientas genmicas

en Biotecnologa agrcola, se aproxima cada da ms a
aquella utilizada en los procedimientos de descubrimiento y
desarrollo de nuevos frmacos de la industria farmacutica.
Dichos procedimientos consisten en:
Identificar el gen o genes precursores de una protena o
de un metabolito de inters o responsables de la virulencia
de un patgeno.
Validar el gen o genes en modelos biolgicos y citolgicos.
Caracterizar las protenas resultantes de la expresin del
gen o genes, incluida la estructura y las interacciones de la
misma.
Conocer los mecanismos de la produccin y acmulo de
los metabolitos de inters.

 En ltimo trmino, desarrollar estrategias para la obtencin

de nuevos productos, nuevas variedades o especies
comestibles.
El objetivo de la genmica es la dilucidacin completa y exacta
de la secuencia de ADN de un genoma haploide representativo
de una especie.
La genmica permitir explotar la variabilidad natural
presente en todos los genomas, tanto vegetales como
animales. Dicha variabilidad permitir tanto gestionar los
recursos almacenados en los bancos de germoplasma, como la
bsqueda de genes de inters tiles en la mejora gentica.

MEJORA GENTICA
Una de las tcnicas mas importantes en la mejora gentica es
la PCR, la aplicacin mas importante es la amplificacin y
posterior deteccin de secuencias de DNA que caracterizan
una especie o variedad. Dichas secuencias de DNA se
denominan marcadores moleculares y son altamente
especficas, permitiendo incluso la diferenciacin entre
individuos de una misma especie en base a su lnea germinal.
En el genoma existen regiones de mayor variabilidad, es
decir, zonas donde se encuentran un mayor nmero de
variaciones entre especies o incluso entre individuos de una
misma especie. Estas secuencias o regiones variables dentro
de un cromosoma se denominan polimorfismos.

Las inserciones dirigidas son sin duda, una de las

principales panaceas perseguidas por los ingenieros
genticos, que a fecha de hoy no han sido resueltas. La
insercin especfica de un gen en un lugar del genoma,
puede lograrse a travs de la recombinacin homloga, asi
como la extraccin especfica de ciertos genes que no
interesan.
La transformacin gnica en el futuro se proyectarn mucho
ms lejos que las actuales conocidas sobre resistencia a
ciertas plagas o herbicidas. Es previsible que en los
prximos aos se cultiven plantas transformadas tanto a
gusto del consumidor como de la industria, incluyendo usos
alimentarios y no alimentarios. As, por ejemplo,
actualmente est bajo estudio comparativo la produccin
industrial de ciertos frmacos como anticuerpos en distintos
sistemas productivos.
Esta aplicacin de la Biotecnologa nos introduce de lleno en
las bio-fabricas: microorganismos, plantas y animales
transformados genticamente para producir metabolitos
y/o protenas de inters.

OBTENCION DE PLANTAS TRANSGENICAS

El mejoramiento gentico vegetal se origin cuando el

hombre se hizo agricultor y comenz la domesticacin
de las plantas.
Con la incorporacin de los cruzamientos sexuales, el
conocimiento de la biologa floral de las especies, los
avances de la gentica se desarrollaron los mtodos de
mejoramiento convencional utilizados actualmente.
El mejoramiento gentico convencional se basa en la
existencia de variabilidad gentica para los caracteres
que se desea mejorar y la reproduccin sexual para la
incorporacin de esos caracteres. Este hecho hace que
el aprovechamiento de la variabilidad est restringido
por barreras de cruzabilidad.

Estas limitaciones ya han sido superadas actualmente

con la tecnologia del ADN recombinante

para lograr una planta transgnica deben ocurrir tres procesos

en la misma clula:
a) El transgen debe ser transferido al interior de la clula
b) El transgen debe integrarse al ADN celular
c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la clula
transgnica en la que se verificaron los procesos a y b.

Construccin del vector

Para introducir un transgen es necesario que sea incorporado
previamente en un vector (por ejemplo un plsmido). Para ello:

Se digiere el ADN extrado de un organismo, cualquiera que

sea su origen, con enzimas de restriccin.

Los fragmentos de restriccin as obtenidos pueden ser ligados

enzimticamente a vectores de clonado, obtenindose, de este
modo, clones de ADN recombinante

Pasos bsicos en la
clonacin de un
fragmento de ADN.
En primer lugar el ADN
a clonar y el vector
(plsmido) se cortan
con la misma enzima
de restriccin. Luego se
ponen en contacto en
presencia de una ligasa
para obtener una
molcula de ADN
recombinante que se
introduce en bacterias
que multiplicarn el
plsmido junto con el
fragmento de inters

VECTORES DE TRANSFORMACIN
Un vector es una molcula de DNA que acta a modo de
vehculo y permite que un gen o fragmento gnico se
introduzca en el organismo diana y se integre en el genoma
de manera estable. Ello permitir que dicho material
gentico, as como la informacin gentica en l contenida,
sea heredado por la descendencia como si de un gen propio
se tratara.
En ocasiones, el carcter expresado por el gen introducido
en el organismo, es importante que se exprese en un
determinado rgano o tejido vegetal o simplemente en
todas las clulas de la planta pero solamente en un
momento determinado, etc. Dichos patrones de expresin
espacio-temporales van a depender de la regin promotora
que dirija la expresin del transgn y son a priori
seleccionados por el investigador en funcin del uso que se
quiera hacer de dicho transgn y forman parte del vector de
expresin y transformacin en el que se inserta el gen de
inters que se desea expresar.

Un transgen est compuesto por

una secuencia codificante (regin comprendida entre los
codones de iniciacin y terminacin de la traduccin)
secuencias regulatorias que determinan el tejido, el
momento del desarrollo y el nivel de expresin del transgen
en la planta.
Por ejemplo, si el gen provienen de bacterias usualmente
no pueden expresarse eficientemente en clulas eucariotas.
para optimizar la expresin del transgen es necesario
reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por
otras aptas para su expresin en clulas vegetales.

SECUENCIAS REGULATORIAS
La secuencia ms importante es el promotor
se distinguen:
Promotores constitutivos, que permiten la expresin del gen
en toda la planta en forma continua.
Promotores inducibles, que responden a factores ambientales
Promotores especficos de
tejido, que
permitirn
transcripcin en determinados rganos y tejidos

la

Al momento de elegir el promotor debe tenerse en cuenta

tambin la planta a transformar ya que algunos de ellos son
menos activos en monocotiledneas, como el 35S; por otra
parte el promotor de ubiquitina 1 (ubi1) de maz es uno de los
ms efectivos en gramneas.

Seales de terminacin
Es indispensable una regin no traducida en el extremo 3,
que incluya la seal de corte y poliadenilacin (terminador),
necesaria para el correcto procesamiento del transcripto
correspondiente.
El nivel y patrn de expresin del gen tambin puede estar
afectado por la posicin del mismo en el genoma de la
planta transformada (efecto de posicin). Esto puede
deberse a la presencia de otras secuencias regulatorias
cercanas, a la estructura de la cromatina, al patrn de
metilacin, etc.
Dirigir la secuencia de inters a sitios especficos del
genoma vegetal, elegidos por su patrn de expresin
adecuado y estable. Esto se puede lograr usando sistemas
de recombinacin sitio-especficos o mediante reemplazo
gnico por recombinacin homloga.

METODOS TRANSFORMACION GENETICA

El primer mtodo de transformacin gentica de plantas fue

la infeccin por Agrobacterium tumefaciens, bacteria que de
manera natural infecta a las clulas de plantas
dicotiledneas, transfiriendo parte de su dotacin gentica
al husped. Si sustituimos los genes que se transfieren de
esta bacteria por los que queremos insertar, se construye
un vector eficaz de transformacin de plantas.
Para las plantas monocotiledneas se ha venido utilizando
otro mtodo, llamado biolstico, consistente en el
bombardeo, con microproyectiles cubiertos de DNA, de
tejidos, embriones inmaduros o clulas a transformar.
Debido
a
que
este
mtodo
presenta
limitaciones
importantes como la baja eficiencia de transformacin, se
est avanzando para optimizar mtodos de transformacin
en plantas.

SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENICA EN PLANTAS

Pueden dividirse en:
SISTEMAS
BIOLOGICOS:
Transformacin
mediada
por
Agrobacterium, virus del tipo Geminuvirus vectores biolgico
que permiten la transferencia gnica.
SISTEMAS
DE
TRANSFORMACIN
GENTICA
DIRECTA,
tambin llamados fsicos, por distintos mecanismos fsicos, se
introduce el ADN en la clula.
Biobalstica, electroporacin, microinyeccin, transformacin
con cationes divalentes, polietilenglicol y liposomas, y fusin
de protoplastos.
La gran mayora de estos mtodos involucra la obtencin de
protoplastos de las clulas vegetales y un protocolo de
regeneracin de plantas a partir de estos.

CLONACION DE ADN FORANEO

Implica:
El conocimiento y aislamiento de secuencias de ADN (genes)
que confieren una caracterstica deseada.

El uso de vectores de clonado (plsmidos, virus) y varias

enzimas (de restriccion, nucleasas, ligasas)

ETAPAS DEL PROCESO DE OBTENCIN DE PLANTAS

TRANSGENICAS
A. Clonado y expresin de los genes de inters.
B. Regeneracin y seleccin
incorporado el gen.

de

plantas

que

hayan

C. Para efectos de plantas transgnicas que actan como

biorreactores, se realiza una extraccin y purificacin
de la protena y una caracterizacin del producto final.

TRANSFORMACIN MEDIADA POR AGROBACTERIUM

El gnero comprende cuatro especies fitopatognicas, dos de
ellas
ampliamente
estudiadas
(A.
tumefaciens
y
A.
rhizogenes). Ambas capaces de infectar una amplia variedad
de dicotiledneas y tienen como blanco de infeccin las
heridas, atacando clulas individuales y provocando su
proliferacin.
A. tumefaciens causa tumores, enfermedad que se conoce
como agalla de la corona y A. rhizogenes induce la
proliferacin de races dando lugar a la enfermedad
denominada raz en cabellera.
La capacidad patognica de estas bacterias esta asociada a la
presencia de megaplsmidos (150-200 Kb) llamados plsmido
Ti. inductor de tumores o Ri inductor de races

Durante la patognesis un fragmentode estos plsmidos

llamado T-DNA (por transfer-DNA), es transferido a la
clula vegetal, donde se integra al ADN cromosmico de la
planta y su expresin causa proliferacin de clulas de la
planta a travs de la sntesis y alteracin de la respuesta a
hormonas vegetales.
El T-DNA contiene genes que se expresan eficientemente en la
clula vegetal infectada y producen sntesis de hormonas
vegetales (llamados oncogenes porque son los responsables
de la proliferacin anormal del tejido) y genes que provocan la
sntesis de opinas (fuente de carbono y nitrgeno para la
bacteria).
El T-DNA est delimitado por dos repeticiones directas
imperfectas de 25 pares de bases (bp) que lo flanquean,
llamadas bordes derecho e izquierdo. Estos bordes son los
nicos elementos en cis necesarios para dirigir el
procesamiento del T-DNA. Cualquier fragmento de ADN
ubicado entre estos bordes puede ser transferido a la clula
vegetal.

ESTRUCTURA DEL T-DNA

Un aspecto destacable de AGROBACTERIUM es que usa la

respuesta de la planta a las heridas (cicatrizacin y
defensa) como quimioatractivo y activador del proceso
de patognesis (adhesin). En eta etapa estn
involucrados los genes cromosmicos (chv A, chv B, chv
E, cel, psc A y att)
Luego de la adhesin de la bacteria a la clula vegetal, se
produce el procesado y la transferencia del T-DNA,
mediados por los genes vir (virulencia) que son inducidos
por azcares y compuestos fenlicos, como la
acetosiringona, producidos por clulas vegetales heridas.
operones esenciales para la transferencia del T-DNA (vir
A, vir B, vir D, vir G)
Operones que permiten incrementar la eficiencia de la
transformacin (vir C, vir E).

Este mecanismo de ingeniera gentica natural es

aprovechado para la transferencia de genes de inters a las
plantas, para lo cual, los oncogenes y genes de sntesis de
opinas, son reemplazados por un marcador seleccionable y el
gen a transferir.
La bacteria se pone en contacto con el explante durante un
cierto tiempo, en l se produce la transferencia del T-DNA
que contiene un gen marcador seleccionable y el o los
transgenes de inters. Posteriormente se transfieren los
explantes a un medio de cultivo que contiene un antibitico
(que acta como bacteriosttico) y el agente selectivo
correspondiente al gen marcador seleccionable utilizado.

Comparacin de
transformacin
indirecta.

tcnicas
directa

de
e

Los
plsmidos
desarmados,

Ti

sin

oncogenes

se

denominan

Resulta difcil introducir genes en un plasmido desarmado

usando tcnicas habituales de ADN recombinante.
Se han desarrollado dos sistemas de vectores para
introducir
genes
en
Agrobacterium:
los
vectores
cointegrados, que deben formar estructuras cointegradas
para replicarse en A. tumefaciens y los vectores binarios,
que son capaces de replicarse en forma autnoma en esta
bacteria.
En los vectores cointegrados, la insercin del ADN que
contiene los transgenes dentro del T-DNA de un plsmido
Ti desarmado se logra por recombinacin homloga.

PLASMIDO COINTEGRADO

Los vectores binarios (dos plasmidos), un plsmido pequeo

con un origen de replicacin de amplio espectro de
hospedantes,
caractersticas
que
permiten
su
fcil
manipulacin gentica usando E. coli como husped, contienen
un T-DNA no oncognico. La introduccin de este plsmido a
una cepa de Agrobacterium que contenga un plsmido llamado
helper de virulencia (con la regin vir intacta y sin TDNA) la
hace apta para la transferencia del T-DNA a las clulas
vegetales.

VECTORES BINARIOS

Transformacin

TRANSFORMACIN DIRECTA O POR MTODOS FSICOS

Transformacin de protoplastos
La introduccin y expresin de ADN forneo en protoplastos
fue el primer mtodo de transferencia directa claramente
demostrado en plantas
Los protoplastos pueden ser aislados en forma mecnica o
por un proceso enzimtico que digiere la pared.
Los protoplastos pueden ser transformados utilizando
polietilenglicol (PEG), electroporacin, microinyeccin o
liposomas.
Tanto el PEG como la electroporacin producen poros en la
membrana plasmtica por alteracin de la polaridad de la
misma y por ellos penetra el ADN forneo.

La microinyeccin es otro mtodo utilizado en la

transformacin de plantas, pero es difcil y laborioso;
consiste en la introduccin de ADN dentro de protoplastos
individuales mediante el uso de capilares de inyeccin y
micro-manipulador
Cabe anotar que el cultivo de protoplastos es la
metodologa ms sofisticada de cultivo in vitro de plantas,
por lo cual representa gran complejidad experimental y no
est disponible ms que para algunas especies y dentro de
ellas particularmente en genotipos modelo.
Por ello se desarrollaron metodologas alternativas de
transformacin directa como la electroporacin de tejidos,
el uso de fibras de carburo de silicio para facilitar la
entrada del ADN en las clulas en cultivo y el bombardeo
con microproyectiles o micropartculas.

BOMBARDEO DE MICROPARTCULAS
Es este proceso micropartculas de oro o tungsteno
cubiertas con ADN son aceleradas por un gas comprimido e
introducidas en clulas vegetales. Estas particulas al ser
disparados a grandes velocidades pueden atravesar la
pared y la membranas de la clula vegetal bombardeada sin
causarle daos letales.
Para el bombardeo se puede emplear cualquier tipo de
explante vegetal, desde clulas o protoplastos hasta
plntulas completas, pasando por tejidos organizados en
embriones y meristemas.
El explante es sometido a un tratamiento osmtico pre y
posbom-bardeo, que produce plasm- isis celular, evitando
que el impacto y la penetracin de las partculas daen las
clulas

Los vectores plasmdicos que se usan en este tipo de

procedimiento slo requieren un origen de replicacin que
permita un alto nmero de copias de los mismos en E. coli,
aspecto que facilita en la prctica la preparacin del ADN
necesario en grandes cantidades para la transformacin
gentica por este mtodo.

TRANSFORMACIN DIRECTA VS. INDIRECTA

Integracin del transgen al ADN cromosmico. A.

tumefaciens posee un mecanismo natural muy eficiente para
transferir, al ncleo celular, el T-DNA que contiene el
transgen y producir una integracin aleatoria en regiones
cromosmicas con actividad transcripcional.
el T-DNA, acompaado de protenas que lo protejen de la
accin de nucleasas. Por el contrario, en el mtodo biolstico
el ADN transferido no est asociado a protenas, por lo que
al ser parcialmente degradado, slo parte del mismo llega al
ncleo donde se produce, con baja eficiencia, la integracin
al azar en el ADN
cromosmico.
La construccin de vectores es mucho ms sencilla en el
caso del mtodo biolstico.

en ambos mtodos la integracin del transgen en el genoma

se produce al azar. Como consecuenciade ello, diferentes
plantas
transgnicas
provenientes
de
un
mismo
experimento, presentan inserciones en distintos sitios del
genoma receptor. Expresion del trangen de forma diferente.
GENES MARCADORES
El gen marcador seleccionable otorga a las clulas
transgnicas que lo expresan una importante ventaja, con
respecto a las clulas no transgnicas, al permitirles crecer
en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo
correspondiente.
el gen man A de E. coli permite a las clulas vegetales que lo
expresan utilizar la manosa como fuente de carbono, lo cual
no es posible para las clulas no transgnicas

El gen gus A proveniente de E. coli codifica para la enzima glucuronidasa.

Esta
protena
puede
ser
detectada
cualitativamente por tincin histoqumica, en presencia de
un
sustrato
especfico,
por
la
produccin
de
un
precipitadoazul-ndigo de fcil visualizacin.
Recientemente, el gen de la protena fluorescente verde, gfp
(green fluorescent protein), aislado de una medusa, se ha
convertido en un gen marcador visualizable in vivo muy
utilizado. Cuando se ilumina con luz ultravioleta o luz azul,
tejidos que contienen clulas que expresan este gen, se
observa un brillo verde fluorescente.

TCNICAS
DE
PRODUCTOS

DETECCIN

DEL

TRANSGEN

SUS

Para ello se emplean tcnicas como:

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), un resultado
positivo indica solamente que en la muestra existe una
secuencia que amplifica con los primers utilizados pero
no indica si el transgen se encuentra incorporado al genoma
de la planta.
Hibridacin southern o Southern blotting, Adems de
indicar la presencia o no de la secuencia de inters, da
informacin acerca de la integracin de la misma en el
genoma de la clula husped (nmero de copias integradas
y nmero de loci en los cuales se produjo la integracin).

Anlisis de ARN: Las tcnicas de RTPCR (transcripcin

reversa seguida de PCR) con la hidridacin de ARN o
Northern blotting pueden resultar valiosas herramientas
para detectar los transcriptos de inters presentes en la
muestra. La RT-PCR presenta algunas ventajas frente al
Northern blotting: se requiere poca cantidad de material,
posee una alta sensibilidad y la muestra es de fcil
preparacin.
ELISA y Western blotting: aquellas plantas que poseen la
secuencia de inters y la expresan como transcripto, pueden
ser analizadas con estas tcnicas inmunolgicas a fin de
determinar la presencia de la protena codificada por el
transgen.

APORTE DE LA TRANSFORMACIN
VARIABILIDAD GENTICA

GENTICA

LA

a) La expresin de secuencias codificantes no existentes

en la especie (ejemplo: protenas insecticidas de origen
bacteriano).
b) La expresin de nuevas formas allicas de genes que ya
estn presentes en el genoma (ejemplo: tolerancia al
glifosato en soja).
c) La expresin de secuencias codificantes presentes en el
genoma pero bajo el control de nuevas secuencias
regulatorias que modifican su nivel o patrn de
expresin (ejemplo: protenas relacionadas a la
patognesis).
d) La inhibicin de la expresin de genes residentes en el
genoma

La inhibicin de la expresin gnica se puede lograr usando

diferentes tcnicas como: cosupresin, antisentido y la
denominada interferencia del ARN. Todas ellas se basan en un
proceso
denominado
silenciamiento
gnico
postranscripcional.
La cosupresin consiste en la obtencin de plantas transgnicas
que expresan un transgen homlogo del gen residente que se
desea silenciar.
La tcnica del ARN antisentido involucra la sntesis de
molculas de ARN que son complementarias al ARNm producido
por la transcripcin del gen que se quiere silenciar.

La interferencia del ARN es parte de un mecanismo

regulatorio natural de la expresin gnica, por ello es
la ms utilizada, para silenciar genes en plantas. La
tcnica se basa en la construccin de transgenes cuyo
producto final es un ARN. Este contiene parte de la
secuencia transcripta del gen a silenciar en forma de
repeticin invertida. Como consecuencia de esta
estructura , cuando este tipo de transgen se transcribe
en la planta se genera un ARN de doble cadena que
dispara el mecanismo de degradacin dependiente de la
secuencia antes mencionado

OBTENCIN DE PLANTAS TRANSPLASTMICAS

La obtencin de plantas transplastmicas ha recibido notable
atencin, el genoma de los plstidos (plastoma) se ha
convertido en un blanco atractivo para la ingeniera gentica
ya que esta tecnologa ofrece una serie de ventajas sobre la
transformacin del genoma nuclear
Se pueden obtener altos niveles de expresin de los
transgenes y elevados niveles de acumulacin de las
protenas codificadas por ellos (hasta el 47% de las protenas
solubles totales).
Es posible expresar un transgen opern con varias
secuencias codificantes bajo el control de un mismo
promotor.
No se observa efecto de posicin debido a que la integracin
del transgen est dirigida a un sitio particular del plastoma.
No se observa silenciamiento de transgenes.

Para las especies que tienen transmisin materna de los

plstidos (la mayora). Se minimiza la dispersin de los
transgenes por el polen debido a la ausencia de
transmisin de los plstidos por el mismo.
A pesar de la naturaleza eminentemente procariota del
sistema gentico de los plstidos, se ha demostrado que
estas organelas pueden procesar protenas eucariotas
permitiendo su correcto plegamiento y la formacin de
puentes disulfuro.
La existencia de secuencias altamente conservadas en el
plastoma de varias especies es explotada para el diseo de
vectores
universales,
potencialmente
tiles
en
la
transformacin de los cloroplastos de numerosas especies.

IMPORTANCIA Y APLICACIONES DE LAS PLANTAS

TRANSGNICAS
Aumento de la productividad de los cultivos
La reduccin en el uso de agroqumicos
La conservacin de la tierra arable, el agua y la energa
La reduccin de la contaminacin del ambiente y los
beneficios para la salud humana derivados de estos
aspectos
Mejoramiento de la calidad nutricional (protenas, aceite,
vitaminas y minerales)
La eliminacin de alergenos
La fitoremediacin (es decir la recuperacin de ambientes
contaminados mediante el uso de plantas)

La utilizacin de
plantas como bioreactores para la
expresin de protenas recombinantes con fines tales
como la produccin de vacunas comestibles, anticuerpos y
otras protenas de uso teraputico o industrial.