UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(UNIVERSIDAD DEL PER, DECANA DE AMRICA, FUNDADA EN 1551)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

EXCLUSIN MOLECULAR ELECTROFORESIS

fredy quispe jacobo

Lima, 29 de noviembre del 2013

EXCLUSIN MOLECULAR
Cromatografa de permeacin en gel
Cromatografa de exclusin de tamao
Tcnica analtica de separacin de
molculas sobre la base de su tamao y
forma

Teora

Soporte
poroso

Columna

Las molculas grandes son excluidas desde los

poros y se mueven a travs de la columna de
manera ms rpida
Las pequeas molculas son atrapadas
pudiendo difundirse dentro de los poros y eluir
lentamente

Perfil de elucin
V
e

V
e

V
e

Ve = Volumen de elucin. Depende de la proporcin de la

matriz porosa disponible para el analito a separar.

Parameters de la Columna

Vo = Volumen
vaco

Vt = Volumen
total

Vs= volumen de
solvente mantenido
en los poros
Vt-Vo= volumen de
soporte

Clculo del Volumen de elucin (Ve)

Para una molcula que puede ingresar a los
poros:
Ve = Vo + Kav (Vt-Vo)
Kav = Proporcin de poros disponibles a la molcula
Totalmente Excluido Kav = 0 and Ve = Vo
Totalmente Incluido Kav = 1 and Ve = Vt

Comportamiento de una molcula

sobre una columna

Kav = Ve Vo
Vt - Vo

Resolucin

La resolucin del analito es proporcional a la raz

cuadrada de la longitud de la columna. Afectada por la
velocidad de la fase mvil en la columna

Separacin en la columna
Tamao de la Columna
Solvente
Inerte al soporte

Matriz/soporte
Consideracion importante
Diferentes tipos
Material
Tamao de poro

Tipos de matriz/soporte
Material
Sephacryl
dextran

Sephadex
dextran

Sepherose
agarose

Superdex
mixture

Sephacryl

Proteina Dextranos
(kD)
(kD)

S-100

1-100

NS

S-200

5-250

1-80

S-300

10-1500 2-400

S-400

20-8000 10-2000

S-500

NS

40-20,000

Aplicacin: Determinacin de la
masa molecular
Calibra la columna con estndares conocidos
Plotear Kav against log Masa molar

ELECTROFORESIS
Tcnica que permite la separacin de molculas en medio
acuoso por efecto de un campo elctrico aplicado.
Cada molcula se desplaza por efecto del campo elctrico,
alcanzando rpidamente una velocidad constante al
equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico)
con la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento)
impuesto por el medio en el que se desplaza.
Fuerza del campo elctrico = Fuerza de friccin
qxE= fxv
q= carga (C), E= intensidad del campo (V x m), f= coeficiente
de friccin (C x V/s), v= velocidad de la molcula (m/s)

 El coeficiente de friccin mide la resistencia intrnseca

debida a las caractersticas de cada molcula,
esencialmente la forma y tamao. As, por ejemplo, las
molculas grandes y asimtricas poseen un mayor
coeficiente de friccin que las pequeas y compactas.
La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de
movilidad electrofortica, u
v/ E= u= q/f =Ze/f
(Z=nmero entero, e= carga del electrn)

TIPOS DE ELECTROFORESIS
A. De frente mvil: los componentes de la muestra estn
presentes en toda la disolucin y se determina pticamente
la posicin del frente de avance, o frontera con el disolvente.
B. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y
sus componentes migran a travs de un disolvente,
utilizando adems un medio soporte de ste. En este caso
no se determina la movilidad, sino que se aplica la tcnica
con el nico objetivo de separar los componentes de la
muestra.
C. Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero
se suministra continuamente a lo largo del proceso

SOPORTE PARA ELECTROFORESIS

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte,
principalmente para evitar perturbaciones mecnicas y
corrientes de conveccin durante la separacin. En algunos
(papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y
avanza a lo largo de ella, con escasa friccin, por lo que el
mecanismo principal de separacin es la magnitud de la carga.
Otros medios (geles, medios semislidos o gelatinosos)
estn formados por polmeros que forman una malla, matriz o
red tridimensional a travs de la cual deben avanzar las
molculas de la muestra, que queda embebida en el medio de
soporte electrofortico. Como consecuencia, la friccin es
notable y el factor forma y tamao adquiere una alta relevancia
en la separacin.

 Papel: sencillo, pero elevada adsorcin de los grupos hidroxilo de la

celulosa
Acetato de celulosa: Grupos OH acetilados, baja adsorcin, baja
tincin de fondo, posible transparentarla o disolverla para detectar y
recuperar.
Almidn: Pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un
tampn caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, sustituido por
la poliacrilamida.
Agarosa: Polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar
al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60 C) y al enfriar solidifica
formando un gel de alta porosidad.
Poliacrilamida: Gel resultado de la polimerizacin qumica de una
mezcla de acrilamida y bis acrilamida. Regulando la concentracin de
ambas y su proporcin se consiguen distintas porosidades, siempre
menores que la de los geles de agarosa.

 Agarosa+poliacrilamida: porosidad intermedia

 Poliacrilamida con SDS: El dodecil sulfato de sodio

(Sodium Dodecyl Sulphate) es un detergente aninico que
se une a las protenas, desnaturalizndolas en una
conformacin extendida recubierta de molculas de SDS.
Como consecuencia, el TAMAO DE LA PROTENA ES
DIRECTAMENTE PROPORCIONAL A SU LONGITUD EN
AMINOCIDOS y su CARGA QUEDA ENMASCARADA
POR LA MAYOR CARGA DEL SDS QUE LA RECUBRE, que
es tambin proporcional a la longitud. Por lo tanto, la
movilidad electrofortica de la protena depende
exclusivamente de su MASA MOLECULAR.

DISPOSICIN DEL SOPORTE PARA

ELECTROFORESIS
HORIZONTAL
En papel, para aminocidos u otras molculas pequeas, y en
soportes similares especialmente, acetato de celulosa para
protenas.
En gel de almidn o de agarosa, para protenas y
especialmente cidos nucleicos. Casi siempre el tampn cubre
el gel (para evitar que se seque por el calentamiento al paso
de la corriente), denominndose electroforesis submarina. El
soporte impregnado de disolucin tampn por capilaridad,
disuelve la muestra y mantiene el contacto elctrico
Se aplica la muestra depositndola (pipeta o aplicador
especfico) como una gota SOBRE el soporte (papel, acetato
de celulosa) o DENTRO de un pocillo creado en el gel.

 VERTICAL
Casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (ms
resistente fsicamente, no se desliza), para protenas o para
cidos nucleicos de pequeo tamao. El gel puede rellenar
tubos de vidrio (cada vez se usa menos) o estar contenido
entre 2 placas rectangulares, contacto elctrico y disolvente
gracias al tampn que embebe el gel y llena las cubetas o
compartimientos del nodo y ctodo.
La muestra se deposita con micropipeta llenando un
pocillo creado al polimerizar el gel. En cuanto a la
composicin del gel hay dos variantes: electroforesis
continua (un solo tipo de gel) y electroforesis discontinua
cuando existen 2 tramos del gel de composicin ligeramente
diferente.

EJEMPLOS DE SEPARACIN ELECTROFORTICA

SEPARACIN DE PROTENAS POR SDS-PAGE discontinua
vertical
SDS-PAGE= SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,
electrophoresis en gel de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato de sodio.
Gel de poliacrilamida, en placa, vertical
Separacin de acuerdo con la masa molecular (estrictamente de
acuerdo con la longitud de la cadena polipeptdica).
La muestra se trata con SDS (a mayor concentracin que en la
composicin del gel) y se calienta brevemente a 90 100 C, para
provocar la desnaturalizacin. Se suele aadir tambin mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro, separando as las
subunidades de la protena y permitiendo que se extiendan por
efecto del SDS.

 En la preparacin se mezclan:
Un tampn de pH (comnmente Tris-HCl)
Acrilamida y bisacrilamida
Agente iniciador de la polimerizacin, como el
persulfato amnico (genera radicales libres)
Un agente catalizador de la polimerizacin, como
el TEMED (N,N,N,N-tetrametiletilenodiamina)
SDS

Para controlar el avance del frente de electroforesis (posicin de mxima

movilidad) se aade a la muestra un colorante marcador tracking dye,
molcula cargada y de tamao pequeo que avanza ms que cualquier
componente de la muestra; el ms habitual es el azul de bromofenol.
Para mejorar la resolucin (obteniendo bandas ms compactas) se
emplea electroforesis discontinua:
En la parte superior, un gel acumulador, concentrador o espaciador apilador (stacking gel) que tiene como efecto concentrar la muestra en
una banda estrecha.
Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador (resolving gel)
en el que tiene lugar la separacin de los componentes.
El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel
acumulador, combinada con una diferente composicin de tampones de
cubeta (Tris-glicina) y de gel (Tris-HCl) y distinto pH para ambos geles.
Tris= Tris(hidroximetil)aminometano, sustancia habitual para preparer
disoluciones tampon de pH prximo a 7.

 Separacin de DNA en geles de agarosa

Es una modalidad de electroforesis horizontal
submarina. Las molculas de DNA de las clulas
son excesivamente grandes para avanzar a travs
de un gel de electroforesis normal, pero pueden
analizarse si previamente se han fragmentado de
forma controlada. Se suelen emplear geles de
agarosa de concentracin entre 0,3 y 2%, ms
porosos que los de poliacrilamida.
Las caractersticas mecnicas de estos geles
hacen aconsejable la realizacin de la
electroforesis en horizontal, habitualmente
submarina. Las muestras se aplican en pocillos
practicados dentro del gel.

 La carga elctrica de una molcula de DNA

depende sus grupos fosfato y el nmero de estos
es igual al doble del nmero de pares de bases. La
forma de todas las molculas de DNA es
esencialmente la misma, en consecuencia resulta
que la movilidad en electroforesis depende
exclusivamente de la longitud de la molcula
(medida habitualmente como un nmero de pares
de bases, pb): la electroforesis separa los
fragmentos de DNA de acuerdo con su longitud
en pb. De forma similar al caso de protenas en
SDS-PAGE, se suelen aplicar patrones en uno de
los pocillos para hacer la curva de calibrado de
tamaos.

TCNICAS ESPECIALES
Isolectroenfoque
Conocido tambin como enfoque isoelctrico o
IEF, de isoelectrofocusing. Tcnica que se
presenta como una variante de electroforesis
donde el gel (poliacrilamida) posee un gradiente
de pH fijado en su estructura. Esto se consigue
incluyendo en su preparacin molculas ionizables
con valores de pK diferentes. Como consecuencia,
al avanzar los componentes de la muestra a lo
largo del gel se encuentran medios de pH
diferente, y eventualmente alcanzan una regin en
la cual el pH es igual al punto isoelctrico del
analito evaluado, y como consecuencia este
detiene su avance. De este modo se alcanza un
equilibrio y se consigue la separacin de los
componentes de la muestra de acuerdo al punto
isoelctrico, que adems se puede caracterizar
porque se conoce el gradiente de pH del gel
(soporte).

 Electroforesis bidimensional

Para lograr separaciones de mezclas complejas, la electroforesis se realiza de 2

direcciones. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilndrico
estrecho que luego se sita como muestra en una SDS-PAGE. Se obtienen as
mapas complejos de bandas, caractersticos de cada muestra que luego se
comparan con muestras similares.

Electroforesis de campo pulsante

Las molculas o fragmentos de DNA de longitud superior a
20-40 kpb no se pueden resolver (separar) empleando
electroforesis convencional en gel de agarosa. Que se debe a
la dificultad de manejo de los geles preparados a bajas
concentraciones de agarosa, inferiores al 0,4%, la
conformacin ms o menos globular que adoptan las
molculas del DNA, y el tamao relativamente grande para
atravesar los poros del gel que imposibilitan su separacin.
Para solucionar el problema se propone una modificacin de
la tcnica, conocida como electroforesis de campo
pulsante (o pulsado, pulsed-field gel electrophoresis,
PFGE).

 Se emplean geles de agarosa al 1% donde se altera peridicamente

la
orientacin
del
campo
elctrico
aplicado,
activando
alternativamente dos pares de electrodos. El frecuente cambio de
direccin del campo elctrico consigue que las molculas se
desplieguen y avancen a travs de los poros en conformacin
extendida. Las molculas de mayor tamao, se reorientan con ms
dificultad, por lo que su avance relativamente ser lento

RESUMEN DE TCNICAS INSTRUMENTALES

1.

Segn interaccin de la radiacin electromagntica con la

materia:

Espectroscopia de emisin atmica: Llama

Espectroscopia de absorcin atmica
Espectroscopia de fluorescencia
Espectroscopia infrarroja
Espectrofotometra UV-Vis
Dispersin de luz: turbidimetra
Espectroscopia fotoacstica
Espectroscopia de RMN
Microscopia electrnica
Emisin, absorcin, fluorescencia y difraccin de rayos X

2. Mtodos electroqumicos:

Potenciometra
Conductimetra
Voltametra

3. Mtodos de separacin:

Cromatografa lquida
Cromatografa en gel e intercambio
Cromatografa de exclusin molecular
Cromatografa planar
Cromatografa de gases
Espectrometra de masas
Electroforesis

4. Mtodos trmicos:

Anlisis trmico diferencial

Termogravimetra
Calorimetra de barrido diferencial

5. Mtodos radioqumicos:

Anlisis por dilucin isotpica

Radioinmunoanlisis

 GRACIAS POR SU ATENCIN