SEMINARIO 1

BIOLOGA CELULAR

ORGANIZACIN ESTRUCTURAL Y
MOLECULAR DE LA CLULA
MICROSCOPIA Y METODOS DE
ESTUDIO DE LA CLULA

Los seres vivos presentan una gran diversidad...

...incluso dentro del Reino Animal....
Escherichia coli
Fuji velvia
...y dentro de los Vertebrados
Gallus gallus
Ginkgo biloba

Xenopus laevis

Agaricus campestris

Homo sapiens
Argiope lobata
Trypanosoma cruzi

Teora celular
(Schleiden y Schwann, 1839)

La clula es la estructura ms simple que posee las

propiedades que caracterizan a los seres vivos
Son capaces de extraer, transformar y utilizar
la materia y la energa almacenada en las
molculas que se encuentran en su entorno
Todos los seres vivos estn formados por una o ms
(metabolismo)
clulas
Pueden reproducirse y autoensamblarse,
generando copias de s mismos

Niveles
SUB-ATMICO

de organizacin de la materia

ATMICO
Las propiedades de los seres vivos

resultan
C
de una serie de niveles
de
organizacin
En
cada
nivel aparecen nuevas
O
MOLECULAR
integrados
propiedades (propiedades
M
emergentes), que constituyen un
P MACROMOLECULAR
salto cualitativo respecto del nivel
L MACROMOLECULAR
anterior
E
COMPLEJO
J
CELULAR
I
En ese sentido, entendemos a la
D
TISULAR
vida biolgica como un conjunto de
A
propiedades emergentes a partir
D
RGANOS
del nivel de organizacin celular.
SISTEMAS DE
RGANOS

...

Las
...por
estructuras
eso se utilizan
de loslas
niveles
siguientes
ms bajos
tienen
unidades
dimensiones
mtricas...muy pequeas....

SUB-ATMICO
ATMICO

C
O
MOLECULAR
M
P MACROMOLECULAR
L MACROMOLECULAR
E
COMPLEJO
J
CELULAR
I
D
TISULAR
A
D
RGANOS
SISTEMAS DE
RGANOS

...

10-10 m

1 nm

10-9 m

1 m

10-6 m

1 mm

10-3 m

Nivel de Organizacin Celular

El estudio de las clulas

membrana plasmtica

nucleolo

ncleo

REG

mitocondria
Aparato de Golgi
REL

Ultraestructura: Microscopa electrnica

Procarionte

Eucarionte

Ncleo

Ausente

Presente

Citoesqueleto

Ausente

Presente

Sistema de
Endomembranas

Ausente

Presente

Dimetro

< 1m
Circular-Desnudo

10-100 m
Con histonas

Cromosomas

Varias copias de un
cromosoma

Distinto nmero de
cromosomas/especie

Endocits- Exocitocis

Ausente

Presente

Presente

Slo en plantas
(Celulosa) y Hongos
(Quitina)

70S (30S+50S)

80S (40S y 60S)

ADN

Pared Celular
Ribosomas

 Dado que las dimensiones de la mayora de las

clulas y de todos los organoides estn por debajo
del lmite de resolucin del ojo humano, es necesario
emplear instrumentos para su visualizacin.
El microscopio ptico nos permite ver las clulas y
tejidos (LR= 0,25 um)
El microscopio electrnico nos permite estudiar la
ultraestructura de las clulas (ej. visualizar
membranas, organoides, inclusiones y detalles de
todos ellos).(LR=2 a 5 Angstroms)

Unidades de medida que se utilizaran en el curso:

1 mm = 1000 m
1 m = 1000 nm
1nm = 10

( m : micrmetro)
( nm : nanmetro)
( : Angstrom )

El microscopio ptico se basa en la utilizacin de la luz

visible

Luz blanca
Distintas longitudes de onda
Ondas electromagnticas
Se desva en su trayecto al pasar por
medios de distinto ndice de refraccin
Al pasar por compuestos coloreados son
absorbidos determinados rayos

Partes del microscopio

Estativo

Pie
Brazo
Platina
Tubo

Parte ptica :

Espejo
Aparato de
Condensador Iluminacin
Diafragma
Objetivo
Ocular

Marcha de rayos
Lado de la lente donde se
forma la imagen

Lado de la lente donde

se ubica el objeto

Centro de la lente
Distancia Focal

Punto focal
Imagen

objeto

Punto focal
objeto
Lente biconvexa

Eje ptico

Lente objetivo

Objeto a una distancia

mayor que la distancia focal

Formacin de la imagen
en el objetivo:
Algunos principios de ptica

La imagen :
se forma por interseccin de rayos: por
eso es real
Tambin es invertida

1) Todo rayo que pasa por el centro de la lente no se desva al atravesarla

2)Todo rayo que corre paralelo al eje ptico
Cuando atraviesa la lente pasa por el punto focal
imagen

3) Todo rayo que pasa por el punto focal objeto

Cuando atraviesa la lente corre paralelo al eje
ptico

* Puede considerarse esta lente como el objetivo del microscopio

(en realidad son varias lentes) .
*La flecha verde(objeto) es equivalente a una estructura del preparado.
*La lente objetivo tiene distancias focales menores que las distancias
Focales del ocular
Entonces .....

La imagen de la lente objetivo

cae dentro de la distancia objeto
focal del . ocular

Lente
objetivo

Lente ocular
Formacin de la imagen del ocular:

La imagen se forma por

proyeccin de rayos:
por eso es virtual

1) Todo rayo que pasa por el centro de la lente no se desva al

atravesarla
2)Todo rayo que corre paralelo al eje ptico
Cuando atraviesa la lente pasa por el punto focal imagen.

3)Para obtener la imagen deben proyectarse los rayos

Lente
objetivo

Lente ocular

La imagen es mayor, virtual e invertida

Clculo del aumento

El aumento o magnificacin se obtiene
multiplicando la magnificacin del objetivo por
la del ocular.
Ejemplos:
Ocular y objetivo seco dbil.: 10X multiplico
por 10X= 100X.
Ocular y objetivo seco fuerte: 10X multiplico
por 40X= 400X.
Ocular y objetivo de inmersin: 10X multiplico
por 100X= 1000X.

Lmite de resolucin (LR)

Es la distancia mnima que debe haber entre dos puntos de un
objeto para que se visualicen como separados
El LR del ojo humano es de 0,1mm

Si estos dos puntos estn separados por una

distancia menor de 0,1 mm se vern como
un solo punto
D

Indice de refraccin (IR) de un medio:

Relacin entre la velocidad de la luz en un determinado medio
EJ : vidrio) y la velocidad de la luz en el vaco.

VIDRIO

AIRE

Cuando un rayo luminoso

pasa de un medio de menor
IR a uno de mayor IR se
aproxima a la lnea normal

AIRE
VIDRIO

Cuando un rayo luminoso pasa

de un medio de mayor IR a uno
de menor IR se aleja de la lnea
normal

Lmite de Resolucin (LR) del microscopio ptico

Depende de
* la longitud de onda utilizada ()
* el ndice de refraccin del medio (n) que se encuentra entre la lente
objetivo y el preparado (n)

LR =

0.61 x
n x sen

Objetivo

0,61

AN

AN : Apertura numrica
n.: .ndice de refraccin del aire = 1
(que est entre el preparado y la lente objetivo)

longitud de onda (Luz blanca:550 nm)

= semingulo de apertura.
Preparado

LR = 0,25m (microscopio Optico )

La frmula de LR tiene un significado fsico:

Seala: 1) El LR es directamente proporcional a
La (a mayor implica mayor LR y a menor
Menor LR).
2) El LR es inversamente proporcional a
La AN que depende del n (ndice de refraccin
Del medio) (a mayor n implica menor LR y a
Menor n implica mayor LR)

Poder de resolucin(PR) : es el poder tiene un microscopio de

Resolver dos puntos cercanos del objeto como diferentes
Como concepto:
Poder de resolucin es la inversamente proporcional al Limite de resolucin

Es decir, a mayor LR implica menor PR y a menor LR implica

Mayor PR.
Pero :
no se puede calcular el PR invirtiendo la frmula matemtica!

Cmo se puede mejorar el Poder Resolutivo del MO?

Se logra un mayor PR si se obtiene un menor LR. Para ello:
LR =

n x sen

0.61

1)

: Utilizando filtro azul

se aproxima
a los 400 nm

Objetivo
Este rayo no contribuye
a formar la imagen

Aire

Objetivo

n=1

2)

Utilizando aceite de inmersin

n =1.52

Aceite de inmersin

El rayo entra dentro de la lente

objetivo y contribuye en la
formacin de la imagen

Hepatocitos observados con el MO. Tcnica de

H&E.

Epitelio intestinal observado con el MO. Tcnica de

coloracin H&E.

Tipo de Microscopios pticos segn

el nmero de oculares
Monoculares
Binoculares
Trinoculares (generalmente el tercer ocular
es para adaptar una cmara fotogrfica, de
video o una salida de seal que puede ir a
un Analizador de Imgenes.

Tipos de microscopios pticos segn

iluminacin:

Campo claro
Campo oscuro
Luz polarizada
Contraste de fase
Contraste diferencial de interferencia (Optica
Nomarsky)
Fluorescencia
Confocal
Invertido.
De proyeccin.

Microscopio de campo oscuro

Se ilumina el objeto de forma oblicua usando un condensador

especial. Slo la luz que impacta oblicuamente al objeto entra
al objetivo.
Empleo de objetivos de baja AN (<1.1)
Permite visualizar objetos que pueden ser de dimensin menor
que la resolucin que corresponde a la AN si la intensidad de
luz es elevada.
El objeto se ve brillante sobre fondo oscuro.
Se ven contornos o bordes, no se ve estructura interna.
Sirven para ver objetos que con campo claro no se ven por
falta de contraste.
Ventaja: Pueden distinguirse, aunque no resolverse, estructuras
que no se distinguen con el MO comn. Pueden visualizarse
clulas vivas

Microscopio de contraste de fase

Convierte las cambios de fase en variaciones de intensida

Diafragma anular y placa de fase en el objetivo (anillo
transparente).

Imagen intermedia formada por interferencia de todos los

rayos
1/2 long onda de dif: anula

1 long onda de dif: suma

Ventaja: estudio de clulas vivas.

Microscopio de interferencia
- Se hacen visibles las diferencias de velocidad que
sufren los
rayos luminosos al atravesar un objeto transparente:
como
diferencias de intensidad o de coloracin.
- Aspecto de relieve.
- Luz blanca polarizada (polarizador).
- Divisin del rayo en dos haces paralelos (prisma de
cuarzo)
- Colector de rayos
- Analizador
- Interferencia entre ambos haces: diferencias de fase
se
convierten en diferencias de intensidad y cambios de

Microscopio de polarizacin
Consta de:
Un polarizador: est debajo del condensador.
Un analizador: Encima de las lentes objetivos.
Cuando estos estn cruzados no hay transmisin de luz
polarizada.
Rotar el objeto para encontrar el brillo mximo o mnimo.
fibras colgenas, fibras musculares estriadas, mielina,
cristales

Propiedades de la fluorescencia
Las molculas fluorescentes absorben la luz de
una determinada longitud de onda y emiten luz de
otra longitud de onda ms larga. Si un componente
de este tipo es iluminado a su longitud de onda
absorbente y visualizado a travs de un filtro que
slo permita pasar la luz de longitud de onda igual
a la de la luz emitida, el componente aparece
brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el
color de la luz es una propiedad caracterstica de la
molcula fluorescente utilizada

Microscopio confocal
Permite que slo observemos el plano que
est situado en el punto de foco del sistema
ptico eliminando, de forma ptica a travs
de un diafragma o "pinhole", la luz
proveniente de los planos que estn fuera de
foco. Este principio fu descrito por Minsky
en los aos 50, pero es a partir de los 80
cuando se empieza a extender su uso.

Microfotografamitocondias
electrnica
de un hepatocito
Ultraestructura:
nucleolo
ncleo
REG
Microscopa
electrnica

El estudio de las clulas

membrana plasmtica

nucleolo

ncleo

REG

mitocondria
Aparato de Golgi
REL

La mayora de los estudios sobre la fisiologa celular

requieren para
su anlisis el aislamiento
del componente
Fraccionamiento
subcelular
celular a ser analizado

Fraccionamiento subcelular
ETAPAS
1- Ruptura de las clulas
Homogenizadores. Se rompen las clulas
con la ayuda de un mbolo rotatorio
que se
ncleos
Conjunto
de mtodos
y tcnicas
que tienen
como objetivo
ajusta
perfectamente
a las gruesas
paredes
de
unobtener
tubo de cristal
especial.
fracciones
puras o enriquecidas
mitocondriasde un determinado

componente celular.

Sonicacin. Consiste en la aplicacin

de
microsomas
ultrasonidos a una suspensin celular. La
intensa agitacin producida destruye
las
ribosomas
membranas celulares.

citosol

celular
homogenato
Uso de detergentes
que solubilizan las
membranas celulares.

Fraccionamiento subcelular
ETAPAS
2- Separacin de componentes
Centrifugacin
La separacin de partculas u
organelas que no presentan una
tendencia a sedimentar
espontneamente, requiere
aumentar la fuerza gravitatoria
a travs de la centrifugacin .

refrigeraci

vaco

Fraccionamiento subcelular
ETAPAS
2- Separacin de componentes

rotor
centrfuga

Fraccionamiento subcelular
ETAPAS
2- Separacin de componentes
Centrifugacin diferencial
La velocidad de sedimentacin
de cada partcula
Mediante centrifugaciones
es proporcional
a suy crecientes
tamao, en
correlativas
sobrenadante
es proporcional a velocidad,
la densidadsedelogran
la partcula
aumenta al incrementarse
la fuerza
separar los principales
gravitatoria
componentes celulares
sedimento o
pellet

Fraccionamiento subcelular
por centrifugacin diferencial

1.000 g
10

homogenato

20.000 g
20

pellet:
mitocondrias,
lisosomas,
peroxisomas

pellet: clulas enteras,

ncleos.

80.000 g
1h
sobrenadante:
citosol
pellet:
ribosomas,
grandes macromolculas

100.000 g
3h
pellet:
microsomas

Gradiente de sacarosa

Fraccionamiento subcelular
por centrifugacin diferencial
Cmo se confirma el xito de la tcnica?
Determinando actividades enzimticas
especficas de una organela

Verificando la morfologa mediante

microscopa electrnica