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COLORANTES Y COLORACIONES EN MICROBIOLOGIA

SECCIN DE POSTGRADO DE CIENCIAS DE LA COMUNICACIN

OBJETIVOS
Que el alumno aprenda las tcnicas de
preparacin de frotis, fijacin y
coloraciones ms utilizadas en el estudio
microbiolgico ya sea a partir de muestras
directas o de cultivos bacterianos.
Identifique las diferentes formas
bacterianas y de importancia clnica.
Conocer el fundamento de las respectivas
coloraciones asi como la aplicabilidad de
las mismas.

FLUJOGRAMA DEL TRABAJO EN MICROBIOLOGIA MEDICA

MUESTRA

COLORACION Y
OBSERVACION
MICROSCOPICA

CULTIVO

ANTIBIOGRAMA

IDENTIFICACION DEL
AGENTE PATOGENO Y
DETERMINACION DE SU
SUSCEPTIBILIDAD A
ANTIBIOTICOS

Por qu colorear las muestras?


El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal (100 u- 105nm) que resultan
difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la clula y el campo microscpico , el medio ms simple de aumentar el contraste es
la utilizacin de colorantes.

IMPORTANCIA
Gracias a las tinciones podemos examinar mejor la forma y el tamao de los microorganismos lo
cual es tarea difcil en una observacin directa.
Nos permite adems, por medio de tinciones especiales, estudiar diferentes estructuras de las
clulas tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas

Colorantes

Son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste


poseen:

grupo cromforo que otorga color a la molcula y


grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de
disociarse electro-lticamente y por lo tanto formar sales, es el
que facilita la unin del colorante a otras sustancias con carga
elctrica.
Los colorantes ms usados son sales, constituidas por
1. ion cargado positivamente
2. ion cargado negativamente
Por ejemplo, azul de metileno es actualmente la sal cloruro azul

COLORANTES: Tipos
a) Sales colorantes: ms comnmente usados
bsicos: Consisten en un catin coloreado unido a un
anin incoloro. Tien la clula bacteriana uniformemente
(cidos nucleicos y los polisacridos cidos )
(cromatina nuclear de pro y eucariotas)
(ms usados en citologa bacteriana).
Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la
fucsina bsica, el cristal violeta

cidos: Tienen el catin incoloro unido a un anin


coloreado. No tien la clula bacteriana, pueden usarse
como color de contraste (coloracin negativa). Tien
estructuras citoplasmticas de las clulas eucariotas(Rx
bsicas)
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina cida y el rojo Congo.

COLORANTES: Tipos
b) Colorantes liposolubles
Se combinan con los componentes
lipdicos de la clula, usados para
revelar la localizacin de los depsitos
de grasa. Ej. Negro Sudn.

TIPOS DE TINCIONES
Pueden ser

SIMPLES
Un solo colorante
Tie o no la clula
Ej.:
Azul de Metileno
Safranina
Nigrosina

DIFERENCIALES

SELECTIVAS

Ms de un colorante
Uno o ms colorantes
Clulas con diferente Estructuras celulares
composicin qumica con distinta composicin
Importancia taxonmicaqumica
Ej.:
Ej.:
Tincin GRAM
Tincin de Esporas
Tincin AAR
Tincin de Flagelos
Tincin de Paredes Cel.
Tincin de Corpsculos
Metacromticos

TCNICAS PARA REALIZAR UNA


PREPARACIN COLOREADA

a) Frotis o pelcula (extensin)


b) La fijacin
c) Coloracin.

TCNICAS PARA REALIZAR UNA


PREPARACIN COLOREADA

a) Frotis o pelcula (extensin)


) Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados

TCNICAS PARA REALIZAR UNA


PREPARACIN COLOREADA
b) La fijacin:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula
las sustancias proteicas)

TIPOS
CON CALOR (O MTODO DE KOCH)
FIJACIN QUMICA: alcohol metlico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman
(partes iguales de etanol absoluto y ter)

Metanol

Lunes

TINCIN SIMPLE DE AZUL DE METILENO: PROCEDIMIENTO

Frotis y fijacin

MUESTRA

2.- Tomar la muestra con el asa


de siembra

3.-Extender sobre el agua y


fijar a la llama del mechero

Tincin

1.- Cubrir la preparacin con Azul de 2.- Lavar con agua, dejar secar y observar al
microscopio
Metileno 1

Micrococcus
luteus

Observacin de bacterias en muestras teidas con coloracin


simple
(colorante Bsico azul de metileno)

Observacion de
levaduras en
muestras teidas
con coloracion
simple (colorante
acido Nigrosina)

Lunes

Tincin negativa.

1.- Colocar una gota de


Nigrosina en un porta

2.- Tomar muestra del


microorganismo con el
asa, flamear el tubo y
tapar

3.- Mezclar con la


Nigrosina
y
extender por todo el
porta. Secar al aire
y observar

cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas

Lunes
Tincin

L-3.2.3.- Tincin de Gram


Frotis y fijacin

MUESTRA
2.- Tomar la muestra
con el asa de siembra

3.- Decolorar con


Alcohol 96 hasta que
no suelte colorante

3.- Extender sobre


el agua y fijar a la
llama del mechero

4.- Lavar con agua

1.- Cubrir la
preparacin con
Cristal Violeta 1

5.- Teir con Safranina 1

2.- Aadir Lugol


(mordiente) durante 1

6.- Lavar con agua,


dejar
secar
y
observar
al
microscopio

Coloracin Gram

Diferencias en las estructura de la pared celular en


Gram Positivas y Gram Negativas

Gram positiva

Gram negativa

Morfologa Bacteriana

Bacterias Esfricas = Cocos


diplococos

cocos en cadena

Tetradas

Sarcinas

cocos en racimo

Bacterias Alargadas = Bacilos


Bacilo aislado

diplobacilo

bacilos en cadena

Bacterias En Espiral = Espirilos

empalizadas
bacilos lado con lado
o en figuras X Y V

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas


Cocos Gram-positivos

Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo

Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos

Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

Finos: forma tpica de Listeria sp

Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas


Cocos Gram-negativos

Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis


Tambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfologa de diplococos.

Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y


Campylobacter sp, como C. jejuni