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Objetivos
Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del ADN.
ADN
(molcula sencilla)
PCR
amplificacin
Muchas
molculas
PCR
Dolan Learning Center
Biology Animation Library
CSHL
Historia
1985 se crea la
tcnica molecular
conocida como
PCR
Kary B. Mullis,
Coorporacion
CETUS
Premio Nobel en
Qumica 1993
Desnaturalizacin
Hibridizacin
Extensin
Desnaturalizacin
Hibridizacin
La temperatura se reduce a 54 C.
Movimiento Browniano.
Enlaces de hidrgeno.
Filamento de ADN.
Bases construidas.
Extensin o Polimerizacin
LINK
Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
-T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *
Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
-T A C G T
-A T G C A T G C A T G C *
*
Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
-T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C *
*
Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
-T A C G T A C
-A T G C A T G C A T G C * *
Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
-T A C G T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *
Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
-T A C G T A C G T
-A T G C A T G C A T G C * *
Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
-T A C G T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C *
*
Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura
Fusin
95C
Hibridizacin
50-60C
Extensin de
La cadena
75C
2do Ciclo
95C
50 - 60C
75C
Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Mltiples ciclos darn un incremento exponencial
en el nmero de copias
PCR LINK
ADN polimerasas
termoestables
Llevan
a cabo la sntesis de ADN dependiente del
templado.
Estabilidad Taq: 9 min at 97C, Pwo >2 hr a 100C
Fidelidad Taq: baja, Pfu: alta
Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3, ej. Taq agrega una A al extremo 3,
especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli
generan extremos romos
Cantidad usada = 5 x 1012 molculas (1.5 unidades)
La mas comnmente usada = Taq ADN polimerasa
Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu
Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis
Oligonucletidos iniciadores
(primers)
Se conoce su secuencia
Es el factor mas importante para la
eficiencia y la especificidad del proceso
Deben estar presentes en exceso (1013 = 30
ciclos, 1 kb)
Requieren de un cuidadoso diseo
Reglas de diseo:
(a) longitud = 18-25 bases
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas
5-NNNNNNNNTATA-3
3-ATATNNNNNNNN-5
3 repetido
5
3
5
3
PCR
3
5
Dmero de primer
5-TATANNNNNNNN-3
3-NNNNNNNNATAT-5
5 repetido
5
3
PCR
5
no hay extensin
5-NNNNNNNNNNNGCA
3-CGT
Formacin de horquillas
PCR
5
3
3
5
3
El ciclo de PCR
Variantes de la PCR
Touchdown PCR
Colony PCR
Multiplex PCR
Hot start PCR
Nested PCR
Inverse PCR
Long PCR
Quantitative real time PCR
Multiplex PCR
Nested PCR
Nested PCR
1era PCR
Esparcido de ADN
2da PCR
ADN especfico
T-3'
3-A
3'-T
Producto de PCR
a partir de Taq
ligamiento
T-3'
3'-T
Primer SP6
Dos 1ras
PCRs
separadas
x
remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar
x
2da PCR
x
Primer T7
RT-PCR LINK
mANR
(sense)
Transcripcin reversa
GSP1 (sense)
AAAAAAAAAA-3
TTTTTTTTTT-5
GSP (antisense)
PCR usando
GSP+GSP1
GSP1
GSP
Requiere el conocimiento de la secuencia para disear GSP and GSP1
Parte Prctica
Amplificacin de DNA de
Fago
Lambda ADN
Bacterifago Lambda ()
Aislado de E. coli W3110 (c/857 sam7
strain)
Usado como sustrato para enzimas de
restriccin
Peso molecular 31.5106 daltons y
genoma de 48502 pares de bases
Vol (ul)
[ ] Fin
[ ] Ini
PCR Buff
1x
dNTP Mix
200uM
Primer 1
0.5
0.2uM
Primer 2/3
0.5
0.2uM
Taq Pol
0.25
1.25U/50ul
DNA Temp
0.5
0.5ng/50ul
dH20
50 (39.25)
Total
50
Sondas control
Sonda control 1
Sonda control 2
5-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3
5-CCACATCCATACCGGGTTTCAC-3
Sonda control 3
5-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3
Preguntas?
Preguntas
Asignacin