Cromatografa

Mgter. Valentn Murillo Torres

Reg 1418

ORIGEN

Mikhail Tswett, 1906

Separacin de pigmentos vegetales usando una
columna de carbonato clcico.

CROMATOGRAFA
La cromatografa es un mtodo de separacin en el
que se aprovechan las diferencias en el
comportamiento de particin entre una fase mvil y
una fase estacionaria para separar los componentes
de una mezcla.

Si es Gas:

Cromatografa gas-liquido (CGL), que es una

cromatografa de particin.

Cromatografa gas-slido (CGS), que es una

cromatografa de adsorcin.

Si es un fluido supercrtico(CFS), puede ser

de particin o de adsorcin

La CLM es un variedad de cromatografa

lquida en fase inversa que contiene
micelas, generalmente de dodecil sulfato
sdico, que actan como modificadores de
la fase mvil, y un solvente orgnico o
alcohol de cadena corta

TERMINOLOGA de IMPORTANCIA

FASE
ESTACIONARIA:
(matriz,
cromatogrfico) componente esttico
cromatografa.

soporte
de la

FASE MVIL: (eluyente) solvente que arrastra a

travs de la columna los componentes de la mezcla
a analizar.

TERMINOLOGA

ELUCIN: paso de fase mvil a travs de una

columna hasta lograr la salida de los solutos.

ELUIDO: fase mvil que se recoge a la salida de una

columna

CROMATOGRAMA: Perfil cromatogrfico, perfil de

elucin. Representacin grfica de la cuantificacin
de solutos en el eludo de una columna.

TERMINOLOGA

VOLUMEN DE ELUCIN: volumen de fase mvil que

pasa a travs de la columna hasta que sale cada soluto.

VOLUMEN MUERTO: volumen de elucin de una

molcula que viaja a travs de la columna con la
velocidad de la fase mvil, que no experimenta ningn
retraso. Tambin se llama volumen de exclusin.

MTODOS CROMATOGRFICOS
De

papel
En capa fina
De gases
De exclusin molecular
Intercambio inico
Particin
Afinidad
HPLC

CROMATOGRAFA EN PAPEL
La cromatografa en papel es una tcnica ampliamente
utilizada en el laboratorio debido a su bajo costo y a la
rapidez del anlisis.
Se realiza colocando el pimento sobre una hoja de
papel filtro y posteriormente ste se coloca en un
disolvente (generalmente un disolvente fcil de
evaporar).

CROMATOGRAFA DE CAPA FINA

La cromatografa en capa fina se basa en la
preparacin de una capa, uniforme, de un adsorbente
mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte.

ventajas

Cromatografa en capa fina (TLC) ofrece un

mtodo rpido, barato y reproducible para
la deteccin de materiales de plantas
medicinales.

Tal material vegetal sigue desempeando

un papel en la identificacin de los
compuestos de plomo para la industria
farmacutica.

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
MOLECULAR
PRINCIPIO: Separacin en funcin del tamao.
TIPOS DE MATRIZ: Polmeros entrecruzados con
poros de un tamao determinado.
Dextranos entrecruzados
Agarosa
Poliacrilamida

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
MOLECULAR

Las molculas grandes fluyen

ms rpido que las pequeas.

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
MOLECULAR
VENTAJAS:
Flexibilidad en cuanto a solvente.
Condiciones poco agresivas.
Proporciona informacin estructural.
DESVENTAJAS:
Poco resolutiva, debido a difusin.
La muestra se diluye.
Es necesario aplicar volmenes muy pequeos.
Etapas finales de protocolos de purificacin.

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
MOLECULAR
APLICACIONES:
Para la determinacin y purificacin de protenas.
Para separacin de molculas de peso molecular

desde algunos cientos hasta varios millones.

Permite estimar el peso molecular de polmeros de

gran tamao o de productos naturales.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO
Es

un mtodo que permite la separacin de

molculas basada en sus propiedades de carga
elctrica. Puede ser usada en casi cualquier tipo de
molcula cargada, incluyendo grandes protenas,
pequeos nucletidos y aminocidos.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO
Intercambiadores inicos:
Intercambio aninico.
Intercambio catinico.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO
VENTAJAS:
Alta resolucin.
Con una misma columna se puede utilizar a
diferentes pH y obtener diversos perfiles de elucin.
DESVENTAJAS:
Las muestras deben estar desalinizadas antes de
ser aplicadas a este tipo de cromatografa.

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
El modo de separacin de la columna de afinidad

es diferente de otros modos de separacin que se

explicaron anteriormente. El gel de relleno es
modificado con ligandos - similares a los grupos
funcionales.
Se basa en una interaccin especfica:

Enzima - sustrato.
Anticuerpo - antgeno.
Receptor- ligando especfico.

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
APLICACIONES:
Purificar y concentrar una sustancia a partir de
una mezcla en una solucin tampn.
Reducir la cantidad de una sustancia en una
mezcla.
Discernir qu compuestos biolgicos se unen a
una sustancia en particular.
Purificar y concentrar una solucin de enzima.

CROMATOGRAFA DE GASES

La cromatografa gaseosa es una tcnica de

separacin y anlisis de mezclas de sustancias
voltiles basado en la distribucin de los
componentes de una mezcla entre dos fases
inmiscibles, una estacionaria y otra mvil.

La fase mvil es un gas inerte.

La fase estacionaria generalmente est constituida

por una columna de metil polisiloxano, o derivados
de ste.

CROMATOGRAFA DE GASES

Funcionamiento

CROMATOGRAFA DE GASES
Tipos de cromatografa de gases:
Cromatografa gas-lquido (GLC)
Esta es la que se utiliza ms ampliamente, y que se
puede llamar simplemente cromatografa de gases
(GC).

Cromatografa gas-slido (GSC)

Este tipo de cromatografa es de aplicacin limitada. Su
nica aplicacin es la separacin de especies
gaseosas de bajo peso molecular.

CROMATOGRAFA DE GASES
Diagrama de un equipo de cromatografa
de gases

1.

2.
3.
4.

5.
6.

Gas de arrastre o
portador.
Puerto de inyeccin.
Una columna.
Un registrador o
cualquier otro
dispositivo de salida
para medir la seal del
detector.
Un detector.
Cromatogramas.

CROMATOGRAFIA DE GASES
VENTAJAS

Alta resolucin.
Velocidad.
Sensibilidad.
Sencillez.
Muy buenos resultados
cuantitativos.

CROMATOGRAFIA DE GASES
DESVENTAJAS
Solo muestras voltiles.
Es
difcil
tratar
compuestos
inicos,
compuestos de elevada
polaridad y compuestos
de
peso
molecular
superior a 600.
La
inyeccin de la
muestra debe ser exacta.

CROMATOGRAFIA DE GASES
APLICACIONES:
Control de calidad de materia prima.
Monitoreo y optimizacin de procesos qumicos.
Anlisis forense.
Control ambiental.
Determinacin de pureza.
Medicina fotoqumica.

CROMATOGRAFA DE
PARTICIN
Fundamento:
Separacin debida a la diferencia
de solubilidades entre ambas
fases. Similar al fenmeno de
extraccin.

CROMATOGRAFA DE
PARTICIN

Existen 2 tipos:

HPLC

La cromatografa de lquidos de alta resolucin, es

un modo de cromatografa en la cual el proceso
de separacin y transferencia de masa es entre la
fase estacionaria y la fase mvil y una temperatura
dada.

HPLC
Componentes principales:
Solvente
Bomba de alta presin
Inyector
Columna
Detector
Graficador

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HPLC
Diagrama Bsico de un sistema de HPLC

HPLC
Clasificacin de los equipos:
Integrados:

Cada una de sus partes estn reunidas en

un gabinete y su intercambio o conexin con otros
componentes es difcil.

Modulares:

Los mdulos son instrumentos individuales

que permiten no solo armar el equipo segn las
necesidades, sino aumentar su complejidad segn esa
necesidad vare.

37

HPLC
Bases de la separacin:
Cuando

la fase mvil y la muestra son forzadas a

atravesar la fase estacionaria, se presentan
diferentes tipos de interacciones: hidrofbicas,
puentes de Hidrgeno, interacciones dipolares y
electrostticas, stas son responsables de la mayor
o menor afinidad de cada uno de los componentes
de la muestra por alguna de las fases.

38

HPLC
Caractersticas en la eleccin del solvente:
Disponible comercialmente
Precio
Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con
productos de calidad de pureza cromatogrfica. Bajo
contenido de impurezas.
Disolver la muestra
Miscible con otros solventes para formar mezclas
tiles

HPLC
VENTAJAS:
Todo el proceso slo toma unos pocos minutos.
Los resultados obtenidos son de una alta resolucin
y son fciles de leer.
DESVENTAJAS
Alto costo del equipo.
Funcionamiento muy complejo.
Debido a la velocidad del proceso, el equipo tiene
una baja sensibilidad a algunos compuestos.

GRACIAS POR SU
ATENCIN