Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
GEL DE AGAROSA Y
POLIACRILAMIDA
Electro:
electricidad
Electroforesis.
Foresis:
Trasladar
OJO, NO CONFUDIR!
HISTORIA
Vin
Thorne:
bioqumico del
Instituto de Virologa
de Glasgow
caracterizar
las
distintas formas de
ADN que se obtenan
de
partculas
purificadas
de
polyomavirus.
TIPOS DE GELES
Agarosa (ADN)
Poliacrilamida
(PROTEINAS)
Gelificacin trmica
Baja Resolucin
Separan fragmentos de
DNA de entre 300 a
10000pb.
Se corren horizonalmente
Son mas fciles de
preparar y manipular
Gelificacin qumica
Alta resolucin.
Separan fragmentos de
DNA <500pb.
Se corren de forma vertial
Son mas complejos de
preparar
ELECTROFORESIS
EN GEL DE
AGAROSA
CARACTERISTICAS
Agarosa
ELECTROFORESIS
EN GEL DE
AGAROSA
Componentes:
Agarosa
Bufer de carga
Bufer de corrida
Frentes de migracin
Muesta de ADN
Bromuro de etidio
ELECTROFORESIS
EN GEL DE
AGAROSA
Etapas de la tcnica
Preparacin de la
Muestra
Preparacin del gel
Preparacin de las
muestras con el
buffer de carga
Carga de la muestra
Corrida del gel
ELECTROFORESIS
EN GEL DE
AGAROSA
Agarosa 1% ---- gr
40 gr-------------100%
X ------------- 1%
ELECTROFORESIS
EN GEL DE
POLIACRILAMIDA
CARACTERSTICAS
En la preparacin del gel, la polimerizacin de los
monmeros de acrilamida produce cadenas lineales. Al
incluir bisacrilamida, sta da lugar a puntos de
ramificacin en el polmero, lo que permite formar una
matriz tridimensional, dando lugar al gel de
poliacrilamida. El tamao de los huecos o poros que
forma la retcula del polmero depende de la
concentracin de acrilamida y del grado de
entrecruzamiento
Desnaturaliza
nte
SDS - PAGE
No
Desnaturaliza
nte
ELECTROFORESIS
EN GEL DE
POLIACRILAMIDA
N, N, N, NTetrametilen-diamina
Gel Stacking
(Empaquetador)
Menor concentracin de
acrilamida
Tamao de poro mayor
pH cido-neutro
0,75 mm grosor
A mayor
concentracin
del gel menor
es el poro.
Sistemas de electrofore
El sistema de electroforesis a emplear depende
de los objetivos a alcanzar, los ms empleados son:
lmite de Kohlraush
NO DESNATURALIZANT
LAS PROTENAS SE SEPARAN POR:
CARGA ELCTRICA
TAMAO y FORMA
VENTAJAS
separa protenas en estado nativo
las protenas siguen siendo funcionales
permite separar complejos proteicos o protenas
multimricas como una unidad
DESVENTAJAS
muchas protenas no migran por no tener carga neta o
se pierden por poseer carga neta positiva
el proceso de separacin es muy lento debido a la
debilidad de la carga neta de las protenas
el proceso de separacin no slo est afectado por el
tamao sino tambin por la forma de la protena
Desnaturalizante
(SDS PAGE)
Se lleva a cabo en condiciones desnaturalizantes:
1.se emplea un agente reductor de puentes ss
generalmente dtt (ditiotreitol) o -mercaptoetanol
2.se emplea el detergente aninico sds
(sodium dodecyl sulfate)
3. generalmente tambin se calienta la
muestramuestra
Los
grupos
alifticos
dodecil se colocan en el
interior, mientras que los
grupos sulfato en la
superficie
CTODO
+
NODO
Preparacin
Para la preparacin del gel separador o inferior (5 ml,
grosor = 0,75 mm), mezclar segn el % deseado:
Ventajas
Separacin rpida de las protenas
La separacin no depende de la forma de la protena nativa
Se puede estimar el peso molecular de las protenas
Aunque desnaturalizadas, las protenas pueden usarse para la
fabricacin de anticuerpos (en la mayora de los casos)
Desventajas
Las protenas separadas estn desnaturalizadas
no son funcionales
BIBLIOGRAFA
GRACIAS!