MOMENTO 2

PURIFICACIN Y
CARACTERIZACIN DE
SACCHAROMYCES CEREVISAE

JOSE LUIS SERRATO PATIO

BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA
211619_5

SACCHAROMYCES
CEREVISIAE

La levadura de cerveza es un hongo

unicelular, un tipo de levadura utilizado
industrialmente en la fabricacin de pan,
cerveza y vino. En su ciclo de vida alternan
dos formas, una haploide y otra diploide

ESTRUCTURA DE LA
INVERTSA
La funcin biolgica
la enzima invertasa
participar
en
metabolismo
de
glucosa.

de
es
el
la

METODO DE
PURIFICACION

PREPARACION DE LA LEVADURA
Se realiza una solucin con agua desionizada
se adiciona tolueno al 3 y carbonato de sodio
al 1, se incuba la solucin por 4 dias, luego se
centrifugaa 4000 g x 20 min, se remueve el
sedimento y se adiciona el etanol. Se
centrifuga de nuevo y asi se obtiene el
sobrenadante que representa el extracto puro
del external invertase isoforums.

CROMATOGRAFA DE GEL DE
INTERCAMBIO UNICO
Se realiza con el
fin de lograr el
equilibrio de la
solucin y se
debe monitorear.

CROMATOGRAFA DE GEL
Se realiza la separacin pro formas y luego la
fraccin correspondiente a las protenas, se
disuelve nuevamente en agua desionizada.

ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA
Se logra separar las molculas
biolgicas en dependencia
fundamentalmente de su carga.

ENFOQUE
ISOELECTRICO
Se logra que las cargas de la protena sean 0
y ya no se muevan mas.

DETERMINACION DE ANALISIS
Y CONCENTRACION DE LA
ACTIVIDAD INVERTASA
La invertasa (25 IL)fue agregada a la solucin
de sacarosa o,3 M en 50 mM de tampn
acetato (475 IL), Ph 4,5. Despus de 5
minutos a 25C la reaccin fue terminada por
la adicion del reactivo acido 2, 4
dinitrosalicilico (500 IL) y mezcla fue cocida en
bao de agua durante 5 minutos. Antes de
sumergirla en la absorbancia 540 nm, fue
agregado 4 ml de agua desionizada.

DETERMINACIN DE LA
CONSTANTE DE CINTICA
Se determino utilizando las condiciones
descritas
del ensayo invertasa y una
concentracin de sacarosa en el rango de 2.5
a 300 nM. La Km se calcula usando
la
transformacion de la ecuacion de michaelisMenten de lineweaver-Burk.

PH Y LA TEMPERATURA OPTIMA
Para determinar el ph optimo de cada una de
las isoformas, el ensayo de la invertsa
describe que fue realizado en 25C pero en
buffer de Mcllvaine (citrato fosfato de sodio y
o,1 M de 0,2 M) con los diferentes valores de
ph en el rango de 3.0 a 8.0. La temperatura
optima
se
determino
utilizando
las
condiciones descritas de ensayo invertasa a
diferentes temperaturas (desde 10 hasta
70C).

ESTABILIDAD TERMAL
Se incubaron muestras de las isoformas de la
invertasa externos (15 U/mL) en agua
desionizada a 60C . Alcuotas (25IL) fueron
tomadas cada 5 min y el residual de la
actividad se midio directamente con las
condiciones descritas de ensayo invertasa.

INMOVILIZACIN DE LA
INVERTASA EXTERNA
Las isoformas de de la invertasa externos se
inmovilizaron sobre Eupergit material poroso
portador demostrado C, sector que contiene oxirano
grupos reactivos frente a amino y sulfihidrilo grupos
de enzimas. Treinta miligramos de euspergit se
aadi a 2 ml de muestra externo isoformas de la
invertasa (diluida con agua desionizada a 32 U/ml y
se agito durante 1 h a temperatura ambiente y
despues se coloca a 4C con agitacion ocasional,
inmovilizando se lavo extensamente con agua
desionizada para eliminar el enzima no unido. Se
expusieron muestras de control de la invertasa a las
mismas condiciones omitiendo eupergit C.