UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA
REPRODUCTIVA
ESTABLECIMIENTO DE LINEAS CELULARES SOMATICAS Y
FETALES EN ALPACAS Vicugna pacos

Ing. LEANDRA LANDEO JURADO

INTRODUCCIN

produccin de clulas donantes

para Transferencia Nuclear.

Permiten estudiar y caracterizar los procesos de desarrollo celular.

produccin de embriones
transgnicos.

Criopreservar material gentico de especies en peligro de extincin

LIMITANTES DE LA TRANSFERENCIA NUCLEAR

Uso clulas en cultivo primario

Uso de clulas inestables
Desconocimiento del comportamiento celular /pasaje
Desconocimiento del tipo celular

ESTABLECIMIENTO DE LINEAS CELULARES

MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL LA OBTENCION DE CULTIVOS

PRIMARIOS

MATERIALES UTILIZADOS EN EL LA OBTENCION DE LINEAS CELULARES

ESTABLECIMIENTO
ESTABLECIMIENTO DE
DE CULTIVOS
CULTIVOS PRIMARIOS
PRIMARIOS
DE
DE CLULAS
CLULAS FETALES
FETALES

Feto de 130 das de gestacin

Transferir los explantes

Obtencin de muestras

Cultivo celular

Obtencin de explante

Estufa de cultivo celula

5 % CO2

ESTABLECIMIENTO
ESTABLECIMIENTO DE
DE CULTIVOS
CULTIVOS PRIMARIOS
PRIMARIOS
DE
DE CLULAS
CLULAS SOMATICAS
SOMATICAS

OBTENCIN DE MUESTRA

CULTIVO POR EXPLANTE

TRANSPORTE DE MUESTRA

OBTENCION DE FIBROBLASTOS
5% DE CO2

Evaluacin de confluencia
celular

Tripsinizacion de clulas confluentes

ESTABLECIMIENTO
ESTABLECIMIENTODE
DELINEAS
LINEASCELULARES
CELULARES
SOMATICAS
SOMATICASYYFETALES
FETALESDE
DEALPACAS
ALPACAS

clulas confluentes

Primer pasaje celular

Cultivo celular por 74 horas

5% CO2

DP=Log (n/no) x 3.33

Evaluacin de confluencia celular

MEDIO DE CRIOPRESERVACIN

10% Dimetil sulfxido (DMSO)

10% Suero Fetal Bovino (FCS)
10% Sultafo de Gentamicina
70% DMEM

18h a -20 C

DETERMINACIN DE LA VIABILIDAD POST-DESCONGELACIN

Bao Maria 37 C
10-15 Minutos

% clulas viables = clulas viables (sin colorear)

50 ul de solucin celular
50 ul de trypan azul

X 100

clulas viables+ clulas muertas (coloreadas)

%CV= 70
X 100
70+ 40
CV=63.6

DISTRIBUCIN DEL EXPERIMENTO

En el presente trabajo de investigacin se evaluaron el % de

confluencia, Doubling de la poblacin (DP) y la Viabilidad de clulas
post descongelacin.
Yij = + Ti + eij
Los componentes del modelo son:
Yij = observaciones (% viabilidad post-descongelacin).
= media general.
Ti = efecto del los tratamientos (clulas somticas y fetales)
eij = error asociado a cada observacin.
Las diferencias estadsticas de los experimentos de viabilidad postdescongelacin fueron
comparados utilizando anlisis de varianza
(ANVA) despus de la transformacin arcsen de los datos. Se utilizaron
la prueba de Duncan para contrastar la diferencia entre promedios.

RESULTADOS:
ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS A PARTIR DE
CLULAS FETALES

- Feto macho de alpaca

-Cultivo celular a los 4 das de haber
establecido el cultivo.

-Clulas confluentes a los 7 das de

haber establecido el cultivo celular.

-70 % de adherencia celular.

-100% de confluencia celular

OBTENCION DE LINEAS CELULARES A PARTIR DE CLULAS FETALES

Figura 3a: Curva de crecimiento de lneas celulares fetales
de alpacas.

Figura 3b: Barras comparativas de divisin celular en cada

pasaje celular de clulas fetales de alpacas

Confluencia a los 3 das de haber

establecido el cultivo celular.

ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS A PARTIR DE CLULAS

SOMATICAS DE ALPACA ADULTA

-Alpaca macho de 2 aos de edad.

-Cultivo celular a los 7 das de haber
establecido el cultivo.
-100 % de adherencia celular.

- Clulas confluentes a los 14 das de haber

establecido el cultivo celular.
- 100% de confluencia celular

OBTENCION DE LINEAS CELULARES

Figura 5a: Comportamiento de la curva de crecimiento
de lneas celulares somticas.

Figura 5b: Barras comparativas de divisin celular en cada

pasaje celular de clulas somticas

DETERMINACION DEL PORCENTAJE DE CONFLUENCIA CELULAR DE

CELULAS ADULTAS Y FETALES
Cuadro 2. Porcentaje de confluencia de
clulas somticas y fetales

TIPO DE
TEJIDO

Confluencia%

Das

Clulas Fetales

100

Clulas somticas

100

14

Lneas fetales

100

Lneas somticas

100

Figura 6. Comportamiento de confluencia en cultivos

primarios y lneas celulares de clulas somticas y
fetales.

DETERMINACION DEL DOUBLING DE LA POBLACION (PD)

Cuadro 3 Doubling de la poblacin celular de lneas celulares procedentes de
clulas fetales y somticas

TIPO DE TEJIDO

DP (Promedio)

N pasaje Celular

Lneas Fetales

0.41

Lneas somticas

0.16

VIABILIDAD POST DESCONGELACION DE LINEAS CELULARES

PROCEDENTES DE FETO Y CELULAS ADULTAS
Cuadro 4. Promedio y desviacin estndar el porcentaje de viabilidad post
descongelacin

TIPO DE TEJIDO

Viabilidad (promedio) %

Desviacin estndar

Lneas Fetales

95.1

3.47

Lneas somticas

96.5

3.32

CONCLUSIONES

1.Fue posible establecer lneas celulares de alpacas como base para ensayo de
Transferencia Nuclear y Transgnesis.
2.Se obtuvo cultivos primarios de clulas somticas y fetales en alpacas a partir de muestras
de piel.
3.El % de confluencia de clulas somticas fue de 100% a los 14 das de haber establecido el
cultivo primario, de igual manera se determin que las clulas fetales de alpacas logran
100% de confluencia a los 7 das de establecido el cultivo primario.
4.Se determin la tasa de divisin de la poblacin de lneas de fibroblastos procedentes de
clulas adultas con un promedio de 0.16 DP y 0.41 DP para las lneas de fibroblastos fetales.
5.Se evalu el % de viabilidad post descongelacin de lneas de fibroblastos procedentes de
clulas adultas con un promedio de 96.5 y 95.1 de viabilidad post-descongelacin para las
lneas de fibroblastos fetales. No encontrando diferencias significativas entre las lneas de
fibroblastos fetales y somticas.