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Caminhos para

o diagnstico
microbiolgico
Indicao dos
testes moleculares
Custo-efetividade
Interpretao
Clssico x
molecular

A indicao dos
testes moleculares
e sua interpretao

CAMINHOS PARA O
DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO
Curso:
A indicao dos
testes moleculares
e sua interpretao

CAMINHOS PARA O
DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO
Deteco do microrganismo
Deteco da resposta imune
Fase aguda
Fase crnica ou cura

DETECO DO
MICRORGANISMO
Genma
Hibridizao, PCR

Protenas
Aglutinao, ELISA, RIE, QL, HPLC

Visualizao direta
Tcnicas de colorao, IFD, P.
monoclonal

Isolamento em cultura

Deteco da resposta
imune
Fase da infeco
Primria ou secundria

Cura
Cronicidade

Serufo JC, Clemente WT. Princpios Gerais do Diagnstico DIPs, 2002, 657-82.

F lu x o g r a m a 1 : E s t u d o m ic r o b io l g ic o

Caminhos para o diagnstico microbiolgico


D o e n a i n f e c c i o s a e p a r a s i t r ia
com
s u s p e it a c l n i c a d o g r u p o d e a g e n t e s

V r u s

B a c t r ia s

v ir o s e s a g u d a s
(q u e u s u a lm e n te
n o e v o lu e m
p / c r o n ific a o

v ir o s e s c r n ic a s
H IV , H C V , H B V
v ir o s e s e m
i m u n o d e f ic i e n t e s

1 .fa s e a g u d a
2 .fa s e d e d o e n a
3 .fa s e d e c u r a

1 .fa s e a g u d a
2 .fa s e c r n ic a
3 .c o n tr o le d e
tr a ta m e n to

(c ic a triz s o ro l g ic a )

flu x o g r a m a 2

com uns
a e r b ic a s
fa c u lta tiv a s
n o f a s t i d io s a s

f a s t id i o s a s
a n a e r b ic a s
in tr a c e lu la r e s

flu x o g r a m a 4

flu x o g r a m a 5

Fungos

P a r a s ito s

O u tro s

lo c a liz a d o s
s is t m ic o s

lo c a liz a d o s
s is t m ic o s
fa s e a g u d a
fa s e c r n ic a

P r io n s
V ir u s id e s
V ir in o s

flu x o g r a m a 7

f lu x o g r a m a 8

f lu x o g r a m a 9

m i c o b a c t r ia s
tu b e r c u lo s a
e a tp ic a s

flu x o g r a m a 3
flu x o g r a m a 6

Serufo JC.
Diagnstico Laboratorial nas Doenas Infecciosas.
In: Couto RC, Pedrosa TG, Nogueira TMG. 3a.ed.,
Medsi, 2003. 904p., p.725-56.

VIROSES CRNICAS
Fase aguda
Fase de latncia
Fase de doena

Viremia
Replicao viral

Resposta imune
Viremia
Diagnstico
Carga viral
Genotipagem

Controle

V ir o s e s : la t n c ia e c r o n ific a o
DIAGNSTICO
DE VRUS QUE
H IV , H C V , H B V , h e s p e s v ir id a e
v ir o s e s e m tr a n s p la n ta d o s
EVOLUEM
e i mPARA
u n o s s u p r i m i dCRONICIDADE
os
fa s e a g u d a
a n tic o r p o s n e g /p o s
a n tg e n o n e g /p o s

H IV
H B V , H C V c r n ic a s
HSV, CM V, EBV,
V Z V , V J B , ...

fa s e d e c r n ic a
la te n te /r e p lic a n te
a n tic o r p o s p o s
a n tg e n o n e g /p o s
la te n te
in c o r p o r a d a
ao genom a
hum ano

1 .s a n g u e e m E D T A
2 .liq u o r , lq u id o s
3 .te c id o a fe ta d o

1 .s a n g u e e m E D T A
2 .liq u o r , lq u id o s
3 .te c id o a fe ta d o

1 .C u ltu r a v ir a l c o m
tip a g e m m o n o c lo n a l
2 .h ib r id iz a o in s itu
3 .A n tg e n o v ir a l

C u ltu r a n e g a tiv a
H ib r id iz a o n e g
V ir e m ia n e g a tiv a

4 .P C R p / d e te c o
g e n o m a v ira l
5 .S o r o lo g ia Ig M , Ig G
6 .A n tg e n o s v ir a is

1 .P C R p / d e te c o l
g e n o m a v ir a l
2 .P C R R N A m
3 .P m o n o c lo n a l

D o e n a a tiv a
r e p lic a o v ir a l
e /o u v ir e r m ia

C o n tr o le d e
tr a ta m e n to
c o m a n tiv ir a is

1 .C o n tr o le d a
r e p lic a o v ir a l
e m te c id o o u
rg o a fe ta d o
1 .H IV : C D 4 /C D 8
2 .B i p s ia : H C V e H B V
3 .P C R in s itu

d ia g n s tic o d e
c e rte z a a p s
E lis a e W e s te r n b lo t
p o s itiv o s

C o n tr o le d a v ir e m ia
1 .s a n g u e e m E D T A
2 .P la s m a c o n g e la d o

1 .s a n g u e e m E D T A
2 .lq u id o c o r p r e o
3 . r g o o u te c id o

1 .C a r g a v ir a l
2 .P C R p / q u a n tific a o
de DNA ou RNAm

1 .H ib r id iz a o
2 .P C R p / d e te c o
d e D N A g e n m ic o
e /o u R N A m

INDICAO DOS TESTES


MOLECULARES

Curso:
A indicao dos
testes moleculares
e sua interpretao

Prof: Jos Carlos Serufo


DCM/FM/UFMG
serufo@medicina.ufmg.br

Indicao dos testes


moleculares
DIAGNSTICO TRATAMENTO

meningoencefalites virais

Quadro clnico sugestivos de meningite:

Aspecto: purulento
Citometria:
Citologia: PMN
Glicorraquia:
Proteinorraquia:

Meningite bacteriana

Febre
Cefalia
Vmitos
Sinais de irritao menngea
Outros

Aspecto: normal ou turvo


Citometria:
Citologia: MN
Glicorraquia: normal
Proteinorraquia: normal ou

Meningite no purulenta

Aspecto: opalescente
Citometria:
Citologia: MN
Glicorraquia:
Proteinorraquia:

Meningite por
micobactrias ou
fungos

Meningites no purulentas
e meningoencefalites

Virais

Neurossfilis

Faixa
etria
Neonatos : VHS 2, CMV, rubola
< 20 anos: VHS 1, varicela-zoster,
sarampo, enterovrus
> 20 anos: VHS 1, varicela-zoster,
enterovrus

Bacteriana inicial

Outras

Pesquisa monoclonal de antgenos virais


Enterovrus
Especificidade ~ 100%
Sensibilidade PM depende do no clulas
Se >100 cls / mm PM ~ PCR
PCR
Coleta:

HSV 1 e 2

Tratamento

2 a 3 ml
Evitar inibidores
(detergentes, xilocana, heparina,
etc.)

Custo-benefcio
Pesquisa monoclonal para enterovrus:
Coxsackie A, Coxsackie B, Echovirus e
outros enterovrus
Reao em cadeia da polimerase (PCR)
para Herpesvrus tipo 1 e tipo 2
Disponibilidade de antivirais

CUSTO EFETIVIDADE

BAIXA CONCENTRAO
VIABILIDADE DO MICRORGANISMO
AGENTES FASTIDIOSOS
VRUS
TEMPO DE CRESCIMENTO

micra

CUSTO EFETIVIDADE
BAIXA CONCENTRAO DO AGENTE

LQUOR
DERRAME PLEURAL
LQUIDO PERICRDICO
ASCITE
ASPIRADO MEDULAR
SANGUE

micra

CUSTO EFETIVIDADE
VIABILIDADE DO MICRORGANISMO
MOMENTO DA COLETA
INCIO DA INFECO
FASE CRNICA

CONSERVAO E TRANSPORTE
POSSIBILIDADE DE CULTIVO

micra

CUSTO EFETIVIDADE
INTRACELULARES
FASTIDIOSOS ANAERBIOS - VRUS
Legionella spp.

L. pneumophila

Chlamydia spp.

C. pneumoniae, C. trachomatis, C. psittaci

Mycoplasma spp.

M. pneumoniae, M. hominis, Ureaplasma urealyticum

Rickettsia spp.

R. rickettsii, R. typhi, R. prowazekii

Anaerbios
Vrus

micra

CUSTO EFETIVIDADE
VRUS DIFICULDADES TCNICAS
Coleta e conservao
Infraestrutura laboratorial
Cultura de clulas

Mtodos convencionais de deteco


Mtodos convencionais de tipagem
Tempo para liberao do resultado
Genoma RNA

micra

CUSTO EFETIVIDADE
TEMPO DE CRESCIMENTO
DIAGNSTICO RPIDO
TIPAGEM
RESISTNCIA A DROGAS
MICOBACTERIAS

Cultura: 2 a 6 semanas
PCR: 1 a 2 dias

HERPESVIRUS

tratamento

Cultura: 5 a 7 dias
PCR: 1 a 2 dias

CUSTO EFETIVIDADE
DESVANTAGENS

CONTAMINAO DA AMOSTRA
PRESENA DE INIBIDORES
VIABILIDADE DOS AGENTES RNA
CUSTO
PADRONIZAO

micra

CUSTO EFETIVIDADE

CUSTO
ACURCIA
VANTAGENS
DESVANTAGENS

CORRESPONDNCIA CLNICA

micra

CUSTO EFETIVIDADE
CORRESPONDNCIA CLNICA
PADRO OURO
PRESENA DO GENOMA
VIABILIDADE DO MICRORGANISMO
ETIOLOGIA DA DOENA

micra

Diagnstico molecular em microbiologia

Pergunta fechada:
A amostra a ser examinada
contm determinado
microrganismo?
micra

Diagnstico molecular em microbiologia

O resultado POSITIVO
confirma a etiologia
da doena atual?

micra

Diagnstico molecular em microbiologia

O resultado NEGATIVO
afasta a hiptese etiolgica
para a doena atual?
micra

VALIDAO DO
RESULTADO

Diagnstico molecular em microbiologia

Validao do resultado
Resultado positivo
Resultado negativo

micra

INTERPRETAO
DOS
RESULTADOS
VALIDADOS

CRITRIOS
BAAR AURAMINA CULTURA
N
N
N
N
N
P
P
P
P

N
N
N
N
P
P
P
P
P

N
P
N
P
P
N
N
P
P

CONCORDNCIA 80,1%

NMERO DE
PCR

AMOSTRAS

N
P
P
N
P
N
P
N
P

44
14
8
1
1
1
2
1
69
141

MTODOS CLSSICOS
X
MOLECULARES

VIAS RESPIRATRIAS MTODOS CLSSICOS


escarro, aspirado, BAL
Presena do
microrganismo
AMOSTRAS DE STIOS ESTREIS
lquor
Baixa concentrao
derrame pleural
de micobactrias
derrame pericrdico
ascite
MTODOS MOLECULARES
tecidos, linfonodos
urina

VIAS RESPIRATRIAS MTODOS CLSSICOS


escarro, aspirado, BAL
BAAR NEGATIVO

BAAR POSITIVO

MTODO
MOLECULAR

CULTURA

PESQUISA
MONOCLONAL

AMOSTRAS DE STIOS ESTREIS


lquor, lquidos corpreos, bipsias e urina

COMO PEDIR EXAMES PARA


DIAGNSTICO MICROBIOLGICO
NO CONTEXTO ATUAL DE
DESENVOLVIMENTO
TECNOLGICO

DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO
CLSSICO
e / ou
MOLECULAR

DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO

Tcnicas diretas de colorao


Tcnicas diretas de flluorescncia
Tcnicas de deteco de antgenos
Culturas convencionais
Culturas automatizadas
Tcnicas moleculares

Tcnicas diretas

Colorao de Gram
Pesquisa de BAAR
Pesquisa direta de fungos
Pesquisa de fungos pela nigrosina
Pesquisa de fungos pelo KOH
Pesquisa de fungos pelo Lactofenol
Colorao de Giemsa

micra

Tcnicas diretas fluorescentes


especficas para vrus
Pesquisa Monoclonal de:
Enterovrus: coxsackievrus A, coxsackievrus B,
echovirus
Herpesvirus: HSV1, HSV2, citomegalovirus, varicela
zoster, epstein barr, HVH 6, HVH 7, HVH 8
adenovrus, rinovrus, vrus respiratrio sincicial,
sarampo, rubeola

micra

Pesquisa
monoclonal

Especificidade: ~100%
qualidade do anticorpo
Sensibilidade: 0 a ~100%
nmero de clulas infectadas
fase da doena

micra

CULTURAS

Cultura convencional
Cultura automatizada
Cultura para anaerbios
Cultura para fungos
Cultura para micobactrias
Cultura para micoplasma/ureaplasma
Cultura para clamdia
Cultura para legionela
Cultura para hemfilos

Cultura para vrus

micra

Variaes da PCR

PCR: Polimerase Chain Reaction


AP-PCR: Amplified Polymorphic
LS-PCR: Low Stringency
LSSP-PCR: Low Stringency Single Primer
RAP-PCR: RNA Arbitrary Primer
RT-PCR: Transcriptase Reverse
Multiplex-PCR
Nested PCR
I-PCR: Inverse

micra

Real Time - PCR

Iniciadores especficos
Quantificao do segmento-alvo
Automao da quantificao
Rapidez e confibilidade
Custos

Diagnstico molecular

Genotipagem

Epidemiologia
Resistncia a drogas
Diagnstico
Tratamento
Prognstico

Diagnstico molecular
Como pedir?
PCR para:

micoplasma, clamdia,
Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittacii,
Legionella pneumophila, M. avium, Nocardia
asteroides, Treponema pallidum, Candida
albicans, leismania, toxoplasma, adenovrus,
rinovrus, coxsackievrus A, coxsackievrus B,
influenza A, influenza B, parainfluenza, ....

micra

Recomendaes na coleta de amostras


para diagnstico molecular
Via de coleta: swab, puno direta,
puno guiada por US
Inibidores
Frascos e inibidores
Espcime: stio e inibidores
Conservao da amostra:
DNA

RNA

micra

DNA chip, microarrays, DNA LabChip...


Different types of different mecanisms

- Molecular Hybridization
DNA Chip, Microarray

- Eletrophorisis (lab-on-a-chip)
MCE Chip

MICROARRAYS

Chip Sondas DNAs


RNAm cDNA (RT)
cDNA *
Hibridizao
Scanner molecular
Gen turned on

DNA CHIP

MICROARRAY E DNA CHIP WHATS THE


DIFFERENCE?
Microarray

DNA Chip

DNA placed on the chip surface.

Synthesized DNA is placed directlly


on the chip surface.

Probe with 600 2.400 bases


Amplified probes by PCR from
cDNA ou EST
Around 10.000 points in a glass
microscopyc slide.

RNA m

Probes with 20 25 bases


Experimental versions: over
1.000.000 points per array.

DNA

MICROARRAY & DNA CHIP


Applications
Identification of drug targets and new drugs validation
Pathogens gene expression
Viral gene expresion during latency phase and infection
Gene expression profile during cell cicle and apoptosis
Genetic of population: studies of genetic variability
Prognosis and prevention of several genetic diseases
Gene identification related to tumors

MICROARRAY WITH TWO MARKERS

MICROARRAY & DNA CHIP


Clusters Analysis

MICROFLUIDIC SYSTEMS
MCE Chip
Chips with different ways of
integration in some reactions
and analytical process
(eletrophorisis,
cromatography, PCR, etc.)

Technology Lab-on-a-chip

LabChip (Agilent)
and Quick DNA Chip (Genolife), (30 min)
30 min
No hybridisation
No - skilled users

30 min
PCR confirmed by
hybridisation
No - skilled users
Colorimetric analysis
AAT workstation

DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

H INFECO?

PRINCPIOS DO DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO
A amostra devidamente coletada deve
ser levada ao laboratrio prontamente
Os cultivos devem ser feitos em meios
frescos e adequados
O valor clnico do exame microbiolgico
no pode ser maior do que a confiana que
merece o laboratrio que o executou
Kolmer JA, Clinical Diagnosis by Laboratory
Examinations,. 1 edio, 1945.

micra