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METODOS

HISTOLOGICOS
Tomado Finn
Genneser
ENRIQUE A. MARTIN ALVA
Doctor en Ciencias Biolgicas
Magister en Microbiologa Clnica
Especialista en Anlisis Clnicos y Biolgicos
C.B.P 3582

R.N.B.E 0090

El arte y la ciencia tienen su


punto de encuentro en el
Metodo ( Bulwer)

Comprensin y Conocimiento = Avances Tecnolgicos


Microscopia Electronica, Fraccionamiento Celular ,
Histoquimica y Tecnologia del Dna
Tecnologia con Material Vivo y Inerte( Inanimado) , en
los dos se empieza con la microscopia.

Lmites de Resolucin aproximados de algunos


sistemas pticos:
Ojo humano: 0,2 mm.
Microscopio Fotnico: 0,2 m.
Microscopio electrnico: 0,2 nm

ANALISIS MICROSCOPICO
La luz cambia al pasar por preparado histolgico, y
corregida con S.L
Las clulas y tejidos se ven incoloros , no hay suficiente
contraste.
El ojo puede diferenciar contrastes de luz por tanto se
debe modificar la luz ( Cmo? )
Colorear los preparados histolgicos ( Absorcin
diferencial de la luz ),por tanto se pueden observan

PODER DE RESOLUCION (d,) Y


AUMENTO
Distancia mnima que debe existir entre dos puntos del objeto
para que se visualicen separados
Calidad de la imagen depende del Poder de resolucin d
Aumento : Relacin entre el tamao de la imagen y del objeto
en valores lineales(determinado por el grado de curvatura de
su superficie y la distancia focal.) = Aumento Vacio , pues no
mejora la calidad
AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular

Factores que determinan el poder de resolucin


Figura 3-3.-Esquema que muestra un objeto (1)
que es atravesado por un haz de rayos luminosos
(2) los cuales son captados por el objetivo (3). Al
formarse el cono de luz proveniente del objeto se
determina un ngulo, tambin llamado de
apertura, donde a representa la mitad del mismo.
Tomado de Kapitza H G. Microscopy from the very
begining (13).
A partir de las observaciones precedentes, nace la
definicin de apertura numrica (AN), cifra a
considerar para determinar el rendimiento de una
lente objetivo (13):
AN = n x sen a
Donde a = la mitad del ngulo de apertura del
objetivo.(15)
n = el ndice de refraccin del medio que se
encuentra entre el objeto y el objetivo.

Otra manera de incrementar la resolucin es creando, del lado de la fuente


luminosa, un cono amplio con un ngulo mayor. Para ello se emplea otro juego
de lentes denominado condensador el cual posee la misma apertura numrica
que el objetivo (fig. 3-4).

Figura 3-4.-El objeto (1) es


iluminado con un rayo de luz (2)
que formar un cono luminoso
frente al objetivo. Se coloc otra
lente (4) que recoge y condensa la
luz antes que ilumine al objeto.
Tomado de Kapitza H G.
Microscopy from the very begining
(13)

Para aumentar an ms la resolucin, adems de agregar un condensador, otra posibilidad


es colocar algn lquido entre la lmina cubreobjeto y el objetivo. Se ha obtenido buenos
resultados con ciertos aceites (aceite de cedro) cuyo ndice de refraccin es igual al del
vidrio cubreobjeto, eliminando toda reflexin de los rayos luminosos (fig. 3-5).

Figura 3-5.-A la izquierda el espacio


entre el cubreobjeto (5) y el objetivo
(3) es ocupado por el aire; a la
derecha el espacio es ocupado por un
lquido de inmersin (6). Aprciese
que el cono de luz y el ngulo a son
mayores con inmersin. Modificado de
de Kapitza H G. Microscopy from the
very begining (13).

El poder de resolucin de un microscopio compuesto de campo claro puede ser


calculado de manera razonable mediante la frmula (13):

Donde delta= resolucin expresada en micrmetros.


lambda = longitud de onda de la luz empleada.
Como la ANobj y la ANcond son iguales, se resume 2AN.
El poder de resolucin de un sistema ptico, depende principalmente de:
Apertura numrica del objetivo y condensador: La relacin apertura/resolucin es
directamente proporcional; a mayor apertura, mayor resolucin.
Longitud de onda de la radiacin electromagntica utilizada: La relacin longitud de
onda/resolucin es inversamente proporcional; a menor longitud de onda, mayor
resolucin.

APERTURA NUMERICA Y PODER


DE RESOLUCION d
NA= n x sen u = Medida de la capacidad del
microscopio para agrupar las refracciones de la luz
producidas por detalles finos del objeto
El poder de resolucin es funcin de la apertura
numrica y de la -longitud
de honda d = 0.61x /NA
Menor d , mayor NA
- NA MAX 1.4 o 1.5
- 0.61 Constante de pro
porcionalidad

Calcular el limite de resolucin de los


diferentes objetivos del microscopio
ptico
10 x
LR= C/NA
LR= 0,55 m(0,61) /
0,30
LR= 1,12 m
40 x
LR= C/NA
LR= 0,55 m(0,61) /
0,65
LR= 0,52 m

100x
LR= C/NA
LR= 0,55 m(0,61) /
1,30
LR= 0,26 m

El Microscopio Compuesto
Los orgenes del microscopio son inciertos; probablemente en Holanda, en la ciudad de Middelburg entre 1590 y 1610, algunas personas
relacionadas con el mundo del espectculo inventaron tanto el microscopio compuesto como el telescopio. Hans Janssen y su hijo Zacharias,
fabricantes de anteojos, se mencionan como posibles inventores. Sin embargo, algunos atribuyen a Galileo Galilei su invencin en la primera mitad
del siglo XVII, gracias a que l difundi el microscopio y su uso. El microscopio compuesto original consista en dos o ms lentes colocadas en un tubo
rgido (17).
Los primeros usuarios bien conocidos fueron M. Malpighi, de Italia, A. van Leeuwenhoek, de Holanda; Hooke y N. Grew, de Inglaterra. Leeuwenhoek
fabric un microscopio simple (17) (fig. 4-1) y Hooke utiliz un microscopio compuestoSin embargo, el microscopio compuesto sera el instrumento
con ms futuro. El instrumento de Hooke del ao 1665 tena las partes bsicas, dos lentes (una que aumentaba la imagen de la otra), una estructura
mecnica, mecanismos de enfoque y un frasco esfrico para concentrar la luz (fig. 4-2). Mejoras considerables se han realizado desde entonces.
Aunque algunos fabricantes como Culpeper y Cuff crearon microscopios apropiados y mejorados por modelos con bases en trpode y la conocida base
en herradura; no obstante, el verdadero microscopio til apareci con la invencin de las lentes acromticas, desarrolladas en Inglaterra por Chester
Moore Hall en 1729. El desarrollo de los instrumentos de ptica es inseparable del de la industria del vidrio y la fabricacin de las lentes (61). Sin
embargo, an era difcil fabricar lentes acromticas poderosas y a finales del siglo XVIII Jan y Harmanus van Deyl lo lograron e iniciaron la
comercializacin de objetivos acromticos. Las lentes con mayores aperturas numricas fueron realizadas alrededor de 1890. Un fabricante famoso
de microscopios de calidad superior era la firma de Powell y de Lealand, quienes elaboraron objetivos de alto poder, apocromticos y de inmersin
con una apertura numrica de 1,50.
Otros creadores fueron Ross y Smith. Karl Zeiss Jena realiz objetivos de inmersin diseados por Ernst Abbe quien fue el fundador de la teora ptica
de las lentes del microscopio y desarroll el diseo de las mismas basado en un procedimiento matemtico riguroso (62). A finales del siglo XIX los
microscopios de campo claro fueron modificados para obtener campo oscuro y polarizacin, detalles que permitieron incrementar el contraste.
A principios del siglo XX la fabricacin de microscopios se concentr en Alemania y en los aos sucesivos se desarroll la fluorescencia, contraste de
fase, interferencia, holografa, luz ultravioleta, rayos X, mtodos con electrones y protones, microscopios computarizados para la observacin,
cuantificacin y anlisis tridimensional. Estos instrumentos abrieron muchas posibilidades en el campo de la microscopa.
Los fabricantes (Leitz, Zeiss, Olympus, y otros) respondieron a muchas necesidades, haciendo microscopios ms efectivos, de uso universal, capaces
de utilizar el tipo de radiacin (luz visible o no) que revele de la mejor manera posible la naturaleza del espcimen y convierta detalles invisibles de
la imagen en un patrn visible que pueda ser analizado

Figura 4-1.-Microscopio de Leeuwenhoek. La


lente est instalada entre dos placas de
bronce. Lo que se quiere observar se coloca en
la punta de un tornillo, de manera que se
puede regular en forma precisa la distancia
entre el objeto y la lente; el observador tiene
que acercar el ojo al instrumento y mirar a
travs de la lente. Modificado de imgenes.
Ministerio de Educacin y Ciencia. Espaa
(60).

Figura 4-2.-Microscopio utilizado


por Hooke. Tomado de Lanfranconi,
M. Historia de la Microscopa. (18).

Partes del Microscopio


Compuesto Moderno
Sistema mecnico: Conjunto de piezas que
sirven de soporte a las lentes y dems
elementos (pie o base, columna, mecanismo de
enfoque, platina, revolver, tubo).
Sistema ptico: Conjunto de lentes
responsables del poder de aumento y resolucin
(objetivos y ocular)
Sistema de Iluminacin: Elementos que
producen las radiaciones (luz visible o no) y
transmiten, reflejan y regulan tanto la
intensidad como la cantidad de rayos que van a
incidir sobre el espcimen (lmpara o fuente de
iluminacin, espejo, condensador y diafragma).
Accesorios: Son aditivos que permiten
extender las capacidades del instrumento

Figura 4-13.-Trayectoria de la luz


en la iluminacin Khler.
Modificado de Davison M,
Abramowitz M. Optical Microscopy.
Olympus Microscopy Resource
Center (15).

Figura 4-14. Las lneas dibujadas desde el ojo a A y R


forman un ngulo, el cual es dos veces ms grande que el
ngulo de las lneas O-W. De igual manera, la distancia del
ojo a la flecha OW es dos veces la distancia del ojo a la
flecha AR. La flecha en AR aparece dos veces ms grande
que la flecha en OW. Las proporciones se mantienen al alejar
o acercar la flecha. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its
History,
Construction
and Applications
(73).
Figura
4-15. Diagrama
que representa
una lente
bi-convexa cercana al ojo
y a una flecha pequea (objeto en estudio) cuyos conos dibujados
representan parte de los rayos de luz divergentes emanados de varios puntos.
Los rayos emanados del objeto muy cercano, al incidir en la pupila, son an
tan divergentes que no permiten formar una imagen enfocada en la retina;
pero al pasar primero por la lente son desviados para formar lneas casi
paralelas que si pueden ser captadas por el ojo si ste est a su vez muy
cercano a la lente. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History,
Construction
and Applications
Figura 4-16.
Sin la lente(73).
colocada en fg el ojo ver la flecha

con el ngulo formado por las lneas punteadas b y c, formando la


imagen bc. Los rayos bf y cg emanados de las extremidades
de la flecha son refractados por la lente hacia el ojo en direccin f
y g, los cuales crean un ngulo visual mayor que hace que la
fecha se vea ms grande (d-e). Tomado de Hogg J. The
Microscope: Its History, Construction and Applications (73).

Figura 4-17. Esquema simplificado que


muestra el trayecto que siguen los rayos
emanados del espcimen en estudio y su
paso a travs de las lentes objetivo y ocular
para la formacin de las imgenes. La flecha
ab corresponde al espcimen, que est
colocado un poco por delante del foco (f) del
objetivo, el cual forma una imagen real,
aumentada e invertida en ab. Esta imagen
se forma por dentro del foco (f ) de la lente
ocular. El ojo del observador percibir a
travs del ocular la imagen virtual,
aumentada y derecha ab de la imagen real
ab. Modificado de Langueron M. Prcis de
Microscopie (11).

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