UNIVERSIDAD NACIONAL

SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS TROPICALES
:CARRERA PROFESIONAL
INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

:TEMA
VIBRIO CHOLERAE
ASIGNATURA: Microbiologa General
DOCENTE: Blg. WILBERT QUISPE ZUIGA
INTEGRANTES: ALBERTO CHICLLASTO CHOQQUE
JOSE LUIS GALLEGOS MEJIA
QUILLABAMBA-2015

INTRODUCCION

La mayora de las epidemias de enfermedades alimenticias son

producidas porVibriosp., el cual es autctono o proviene del
medio marino, y han ocurrido por almacenamiento inadecuado o
contaminacin de fuentes de alimentos crudos.

Vibrio

choleraees

humanos,

una

causando

importante

formas

causa

severas

como

de

clera

diarrea

en

los

profusa,

vmitos y dolores musculares. La transmisin de este organismo

est

asociado

con

el

consumo

de

alimentos

contaminados,

principalmente de origen marino, y con frecuencia de aguas

contaminadas.

Objetivo
General

OBJETIVOS

Determinacin de la bacteria Vibrio

Cholerae.
Objetivo
Especifico
Determinar los medios de cultivo
Explicar el fundamento de cada
etapa del anlisis.
Conocer el anlisis microbiolgico
para detectar el Vibrio cholerae
en alimentos, agua y/o hielo.

MARCO TEORICO

VIBRIO CHOLERAE:
Clasificacin cientfica:
REINO

Bacteria

FILO

Proteobacteria

CLASE

Gamma Proteobacteria

ORDEN

Vibrionales

FAMILIA

Vibrionaceae

GENERO

Vibrio

ESPECIE

V. Cholerae

NOMBRE BINOMIAL

Vibrion Cholerae

Microbiologa
Presenta forma de coma, mide entre 0.2
y 0.4 m por 1.5 a 2.4 m, los
requerimientos ambientales son: el
rango de temperaturas de crecimiento
estn entre 16 y 42 0C con un ptimo de
37 0C, con un rango de pH de 6.8 a 10.2
y un pH ptimo de 7.0 a 8.0.
Vibrio es un gnero de bacterias Gram
negativas con forma de bacilos curvados
bioqumicamente se caracterizan por dar
positivo en las pruebas de la catalasa y
de la oxidasa. Es una bacteria anaerobia
facultativa, y su metabolismo es
fermentativo; pueden fermentar, entre
otros sustratos, la glucosa. Poseen
flagelacin polar, que les otorga una
movilidad
mxima.
Pese
a
que
nutricionalmente son poco exigentes.

EXISTEN DIFERENTES TIPOS DE VIBRIO CHOLERAE

Vibrio spp. Haloflicos

V. fluvialis
V. hollisae
V. alginolyticus
V. furnissii
V. metschnikovii,
se han asociado con gastroenteritis y estn presentes en
ambientes estuarios junto con otras especies patgenas y no
patgenas de Vibrio.

HBITAT NATURAL
Se lo ha encontrado en ambientes marinos en regiones
templadas o tropicales, en lagos y ros, en moluscos y
crustceos, en pjaros y herbvoros an lejos de las
costas marinas. El nmero de bacterias de Vibrio
cholerae disminuye a medida que la temperatura del
agua baja por debajo de 20C. La enfermedad humana
resulta de la ingestin de agua contaminada o del
consumo de alimentos contaminados.

ALIMENTOS CONTAMINADOS POR EL VIBRIO CHOLERAE:

Las enfermedades transmitidas
por alimentos (ETAs), pueden ser
de tipo infeccioso y de origen
qumico, como las intoxicaciones.
Entre los alimentos involucrados
en ETAs que estn contaminados
por V. cholerae resaltan: los
moluscos bivalvos as como los
crustceos y los pescados frescos
refrigerados y/o congelados.
Estos productos pueden generar
enfermedades a los
consumidores debido a que
desde su origen estn sometidos
a contaminacin microbiolgica y
qumica entre otras, aunado a la
forma de consumo que en
muchos casos es cruda.

AISLAMIENTO, IDENTIFICACIN Y
CARACTERIZACIN DE VIBRIO CHOLERAE:

El mtodo de deteccin estndar para la

recuperacin y la deteccin de Vibrio cholerae es
cualitativo este mtodo describe un esquema
general que consiste en:
Enriquecimiento a diferentes temperaturas:
Dependiendo del tipo de alimento que se desee
analizar, donde se pretende incrementar las
poblaciones de Vibrio e inhibir otros microorganismos
presentes en la muestra.
Aislamiento
diferencial
en
medio
slido
selectivo: El cual restringe el crecimiento de otros
gneros diferentes a Vibrio, permitiendo el
reconocimiento de colonias sospechosas de la
especie Vibrio cholerae.
Purificacin:
Las
colonias
caractersticas
sospechosas de pertenecer a la especie cholerae, se
purifican en medios no selectivos.
Identificacin
bioqumica:
Que
permite
identificacin de los cultivos de V. cholerae.

la

Pruebas

la

serolgicas:

Que

permitan

IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN
DE V. CHOLERAE:
MATERIALES
Ansa aguja
Mechero Bunsen
Estufa a 37C
Placas de petri estriles
Balanza

1. Enriquecimiento:
PROCEDIMIENTO
TIPO DE
PREPARACIN DE LA MUESTRA
MUESTRA

Agua y Hielo

25.0 mL del agua o hielo fundido en 225.0 mL de APA, o bien,

filtrar 500-1000 mL y colocar la membrana en un tubo con 10.0
mL de APA.
Se puede incubar a una bien a dos temperaturas
diferentes
Crustceos
Realizar dos mezclas con 10 crustceos y un peso aprox. de 250.0
frescos,
g c/u.
refrigerados o De cada mezcla tomar 25.0 g y colocar en 225.0 mL de APA.
congelados
Homogeneizar 2 min.

De cada mezcla realizar 2 diluciones ms en 9.0 90.0 mL de

APA.

Pescados
Tomar carne del rea de las vsceras, incluyendo stas.
frescos,
25.0 g de la muestra en 225.0 mL de APA. Homogeneizar 2 min.
refrigerados o Realizar 2 diluciones ms en 9.0 90.0 mL de APA.
congelados

Moluscos
Desconchar 10-12 moluscos (carne y lquido).
bivalvos,
50.0 g de la muestra en 450.0 mL APA. Homogeneizar 2 min.
frescos,
Dividir en 2 matraces estriles.
refrigerados o Realizar 2 diluciones ms en 9.0 90.0 mL de APA.
congelados

Quesos de
A 50,0 g de queso en cubos de aprox 6 mm y pasar a vasos de 2
suero
litros.
Aadir 800,0 a 1000,0 ml de solucin hirviente de cido fosfrico

(1:40).
Agitar continuamente a baja velocidad por 20 minutos hasta
disolver la muestra.
Filtrar y lavar la muestra para evitar que el filtro se obstruya.
En caso de obstruccin agregar al agua de lavado una solucin

TEMPERATURA DE
INCUBACIN DEL
PREENRIQUECIMIENTO
35-37C/24 h
42C/24 h

X
(3 diluciones)

X
(3 diluciones

X
(3 diluciones)

------

X
(3 diluciones)

X
(3 diluciones)

X
(6 diluciones)

------

DETERMINACIN DE V. cholerae EN AGUA Y

HIELO

Incubar un matraz a 35-37C y otro a 42C/24

Aadir 25.0 mL de agua o hielo fundido en

2 matraces con 225.0 mL de APA, o bien
filtrar 500-1000 mL y poner la membrana
en un tubo con 10.0 mL de APA

Despus de la incubacin y sin agitar la

pelcula, de cada matraz efectuar
aislamiento en uno de los sigs. Medios de
cultivo: TCBS (mCPC opcional adems del
TCBS).
Seleccionar al
menos 3 colonias
sospechosas de
cada placa y aislar

Aislamiento en medios selectivos y

diferenciales

Resultados positivos para V. cholerae

DETERMINACIN DE V. cholerae EN PESCADOS FRESCOS,

REFRIGERADOS O CONGELADOS; QUESOS Y HELADOS.

Pesar 25.0 g de pescado

incluyendo vsceraso
helado
Pesar 50.0 g de queso

Seleccionar
al menos 3
colonias
sospechosas
de cada
placa y aislar

225.0 mL de APA y
realizar 2 dil. seriadas en
(5 dil para helado) 9.0
90.0 mL APA. En queso
diluir en 500 ml de APA y
realizar 5 dil seriadas en
9.0 o 90.0 ml APA

Incubar, TCBS 18 - 24
h a 35-37C. sacarosa
(+) = amarillo
mCPC 18-24 h a 39
-40C. celobiosa

Incubar a 3537C / 24 h.
Despus de la
incubacin y sin
agitar la
pelcula,
efectuar
aislamiento en
uno de los sigs.
medios de
cultivo: TCBS
(mCPC opcional
adems del
TCBS).

Resultados
positivos
para V.
cholerae

2. Resiembra
Despus de la incubacin, y sin agitar la pelcula transferir el inculo a una placa de agar TCBS y
optativo mCPC adems del TCBS:
1. Agar con tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS). Incubar durante a 35-37C durante 18 a
24 h.
2. Agar modificado con celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC). La polimixina inhibe al biotipo
Clsico de V. cholerae. Incubar durante 18 a 24 h. de 39-40C.

3. Morfologa colonial:
Examinar las placas a fin de determinar si se presentan las caractersticas coloniales que a
continuacin se describen:
Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae (El Tor y Clsico) son grandes, lisas, amarillas (positivas para la
fermentacin de la sacarosa) y ligeramente achatadas, con el centro opaco y los bordes translcidos.
NOTA:
Las especies de Vibrio no producen colonias pequeas de color crema en agar TCBS, en cambio las
colonias de V. mimicus, que estn estrechamente relacionadas con V. cholerae, son verdes (sacarosa
negativas). La mayora de las dems especies de Vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias
amarillas y verdes.

4. Seleccin:
Seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislarlas en:
1. Agar T1N1 o agar soya tripticasa con 2% de NaCl e incubar a 35-37C durante
12-18 h.. Es necesario hacer un cultivo en un medio no selectivo a fin de
garantizar la pureza de las colonias antes de las pruebas bioqumicas, esto es, se
puede inocular en:
2. Agar gelatina (GA) o agar gelatina sal (GS) en el segundo da. Los resultados
sern confiables si las placas de aislamiento y la observacin microscpica
muestran que las colonias elegidas estn puras.
5. Diferenciacin:
La frmula para todos los medios de pruebas bioqumicas deber contener por lo
menos un 2% de NaCl.
Se recomiendan los siguientes medios porque las reacciones permiten efectuar
una diferenciacin presuntiva entre la mayora de las especies de Vibrio,
Aeromonas, Plesiomonas y otras bacterias. La diferenciacin de las colonias
sospechosas se realiza por duplicado en:

Prueba de oxidasa:
Colocar un crculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con
algunas gotas de reactivo de oxidasa. Alternativamente se puede utilizar un
disco reactivo comercial.
Tomar suavemente una porcin del cultivo desarrollado en agar soya
tripticasa con NaCl al 2%, u otro medio que no contenga carbohidratos
fermentables (Inciso 4) y depositarlo en el papel filtro anterior.
NOTA:
Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornar prpura
oscuro o azul en pocos segundos. Las especies patgenas de Vibrio son
oxidasa positiva (excepto el V. metschnnikovii).

Agar triple azcar hierro (TSI) y Agar Kligler hierro (KIA):

Registrar las caractersticas del medio TSI y KIA antes de la inoculacin (color
del medio).
Tomar suavemente una porcin del centro de la colonia con asa
bacteriolgica recta y estril e inocular por picadura y estra en un tubo con
agar triple azcar hierro (TSI) y agar de Kligler (KIA) inclinado.
Incubar el medio TSI y KIA a 35 2C durante 18 a 24 h.

Agar arginina y glucosa (AAG):

Registrar las caractersticas del medio AAG antes de la inoculacin (color del

Prueba de halofilia:
1. Tomar suavemente una porcin del cultivo desarrollado en KIA o TSI o AAG con asa
bacteriolgica estril y suspender el inculo en un tubo con los siguientes medios:
Caldo triptona con NaCl al 0% (T1N0)
Caldo triptona con NaCl al 3% (T1N3)
Caldo triptona con NaCl al 6% (T1N6).
2. Incubar los medios a 35 2C durante 18 a 24 h.

Prueba de halofilia alternativa.

Alternativamente se realiza la prueba de halofilia en cajas de Petri con los siguientes
medios de cultivo:
Agar gelatina (GA)
Agar gelatina con NaCl al 3% (GS 3%)
Agar gelatina con NaCl al 6% (GS 6%)
1. Dividir cada placa en ocho sectores. Tomar suavemente una porcin del cultivo
desarrollado en KIA o TSI o AAG con asa bacteriolgica estril e inocular en el centro
de cada sector una estra recta.
2. Incubar a 35-37C durante 18 a 24 h..
NOTA:
V. cholerae y V. mimicus crecen al 0% y al 3% de sal, rara vez al 6% de sal y no

Prueba de oxidacin-fermentacin.
Tomar suavemente una porcin del cultivo desarrollado en KIA o
TSI o AAG con asa bacteriolgica estril e inocular por picadura
en un tubo con el medio Hugh-Leifson.
Aadir una capa de aceite mineral estril a uno de los tubos
para incubacin en anaerobiosis.
Incubar ambos tubos a 35-37C durante 18 a 24 h.

NOTA:
Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la
oxidacin como para la fermentacin. Las especies de
Pseudomonas, que comnmente se aslan del pescado y los
mariscos con mtodos de enriquecimiento que se usan para las
especies de Vibrio, utilizan slo la glucosa para la oxidacin.

PRUEBA SEROLGICA DE AGLUTINACIN.

1.

Inocular los cultivos sospechosos presuntivos en agar tripticasa

soya (TSA) e incubar a 35-37C durante 16 a 24 h.

2.

Colocar con una asa bacteriolgica, dos gotas separadas de

solucin salina estril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en
dos secciones de una placa para aglutinacin.

3.

Suspender en cada una de las gotas, una porcin del cultivo

desarrollado en TSA.

4.

Agregar a una de ellas una gota del suero anti Vibrio cholerae
Grupo O1 subgrupo Inaba (factor AC) y mezclar con el canto del
asa o empleando aplicadores de madera.

5.

Agitar inclinando la lmina

aproximadamente un minuto.

6.

Observar bajo una buena iluminacin y sobre un fondo oscuro la

reaccin.

7.

Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva.

8.

Realizar el mismo procedimiento con el suero anti Vibrio cholerae

Grupo O1 subgrupo Ogawa (factor AB).

NOTA:

hacer

girar

las

gotas

durante

Conservacin de aislamientos de V. cholerae

Para la conservacin de aislamientos de V. cholerae, se recomienda:

Conservacin a temperatura ambiente:

Realizar una puncin a partir del cultivo puro, en agar blando
(preparado con caldo tripticasa soja o caldo nutritivo con el agregado
de agar 0.8% y dispensado en viales de 2 ml con tapa a rosca y oring, no ms de 1 ml de medio por tubo). El inculo para esta puncin
puede tomarse con ansa de punta a partir de la estra empleada para
las pruebas de serotipificacin. Los viales de agar blando con las
conservaciones de V. cholerae deben ser correctamente cerrados,
incubados a 37C durante 18 hs. y luego mantenerse a temperatura
ambiente.

Conservacin a -70C:
A partir del cultivo puro (estra utilizada para serotipificacin), inocular
un caldo tripticasa soja o caldo nutritivo, utilizando un ansa de rulo;
incubar 6 a 8 hs. a 37 C; tomar 1 ml del caldo luego de esta
incubacin y dispensar en criotubo estril con tapa a rosca de
capacidad 2 ml. Agregar 0,4 ml de glicerol estril y mezclar
vigorosamente con vortex para homogeneizar el cultivo con glicerol;
inmediatamente llevar al freezer a -70 C.

ransporte de muestras y aislamientos

El acondicionamiento seguro de muestras para
diagnstico bacteriolgico es responsabilidad de
todos los involucrados en el proceso: el profesional,
el responsable del laboratorio y el personal de la
empresa de transporte. El embalaje de los
materiales infecciosos debe evitar la fuga de los
mismos por rotura o mal empaque del envo.

Los materiales para diagnstico se deben enviar en

el sistema de triple envase de acuerdo a las
recomendaciones de la Organizacin Mundial de la
Salud.
El sistema consiste de:
Recipiente primario, a prueba de prdidas,
con cierre hermtico (tubo pequeo o vial),
en el cual se coloca la muestra.
Recipiente secundario, resistente, a prueba
de fugas, impermeable, donde se incluye el
recipiente primario.

El espacio entre los recipientes primario y

secundario
se
debe
llenar
con
material
absorbente, para retener el contenido del
recipiente primario en caso que ocurra una
prdida durante el transporte. Los formularios con
datos de la muestra, notas y todo otro tipo de
informacin que identifiquen o describan a la
muestra, al remitente y al destinatario, se deben
colocar alrededor del recipiente secundario (ver la
siguiente figura).
Se recomienda enviar los aislamientos de V.
cholerae en puncin, en agar blando
(preparado con caldo tripticasa soja o caldo
nutritivo con el agregado de agar 0.8% segn lo
descripto ms arriba), en viales de 2 ml con tapa a
rosca, dispensando no ms de 1 ml de medio por
tubo. Utilizar el sistema de triple envase
recomendado arriba y enviar a temperatura
ambiente.
Se solicita acompaar cada aislamiento con su
ficha correspondiente, donde se consignarn los
datos disponibles de la cepa y muestra de origen.

PREVENCIN
La mejor medida para la prevencin de la infeccin
es realizar una adecuada higiene personal y
ambiental, medidas preventivas que pueden
resumirse en 3 puntos fundamentales:
Un suministro adecuado de agua potable,
El desecho higinico de las heces humanas,
Educacin y una buena higiene en los alimentos
1. Disposicin de adecuado abastecimiento de
agua potable, implementacin de red de suministro
y plantas potabilizadoras para las zonas que lo
necesiten y en caso necesario desinfectar el agua
cuando se traslada en camiones cisterna. S el tipo
de abastecimiento no es el mencionado aconsejar
agregar cloro y s no es posible hervir el agua 2 o 3
minutos.
2. El otro punto clave es la eliminacin de heces y
el tratamiento de aguas servidas para evitar la
contaminacin de ros y lagos por materias fecales.
En las zonas donde efectivamente se comprueban
casos clnicos esta medida es fundamental para
detener la epidemia.

Las campaas masivas de educacin de promocin

CONCLUSIONES
La bacteria llamada Vibrio Cholerae es uno de los
microorganismos que ha provocado la muerte de
muchas personas. Por tanto debemos mantener una
adecuada higiene tanto en lo personal como en los
alimentos no solo para este tipo de microorganismo
sino para cualquier otro tipo el cual sea una amenaza
para nuestra salud.

Gracias!!!