AISLAMIENTO Y

CONSERVACIN DE HONGOS

El diagnstico de Micosis
Requiere de la observacin de un conjunto
de signos y sntomas de las infecciones
por hongos. En clulas diferentes clulas
vivas de: Vegetales, Animales y Humanos

Muchos hongos patgenos muestran

una especificidad hacia el rgano al
cual se unen, puede ser superficial o
profunda no atacan a todas los
tejidos.

Penetracin de la cutcula
Para el crecimiento activo del hongo tras
la invasin del tejido es necesario que se
establezca una relacin parasitaria
continuada con el husped.
A partir de la hifa que penetra en la
planta se desarrollan las hifas primarias
y varias hifas secundarias filamentosas,
que son las encargadas de colonizar el
tejido del vegetal por crecimiento
intercelular y/o intracelular.

PRINCIPALES SNTOMAS Y SIGNOS DE ENFERMEDADES

CAUSADAS POR HONGOS.

Cambio de color: Manchas foliares

Manchas foliares en vid

ocacionadas por
Plasmopara viticola

Manchas foliares en
manzana ocasionadas por
Venturia inaequalis

Podredumbre hmeda:

Podredumbre en
fruto de
tomateproducida
por Rhizopus sp.

Podredumbre en
fruto de zapallo
producida por
Fusarium spp.

Podredumbre en
fruto en manzana
producida por
Penicillium
expansum

Hoja de vid con mildiu (mitad izquierda) comparndolo

con el oidio (mitad derecha).

Sntomas en races y cuello

Principales enfermedades fngicas que

afectan a los animales domsticos

ENFERMEDADES FNGICAS EN VETERINARIA

Tia

Tia del caballo

Trichophyton equinum

Es la tia del caballo. Cuando se asla,

forma unos microconidios. Se hace una
prueba con cido nicotnico porque si no
tiene nicotinamida o cido nicotnico en el
medio de cultivo, no crece.

TRICOPHYTON

LESIONES EN HUMANOS

DIAGNOSTICO

1.- observacin de los sntomas

2.- Recoleccin y transporte de muestras
3.- procesamiento de las muestras
4.- Examen Directo observacin
microscpica
5.- Cultivos: Lquidos y Slidos.6.- Microcultivos- Identificacin
7.- Bioqumica Serologan- PCR.

Diagnstico
Visualizar micelios en la muestra
(dicotomizado en 45)
Aislamiento e identificacin del hongo
en muestras seriadas.
La histopatologa es diagnstico de
certeza.
Deteccin de IgG por ID, CIEF, Fc.

Aspergillus en cultivos, y en
microscopia de contraste de fase

 Clnico
Epidemiolgico
Laboratorio:
Estudio Micolgico
- Ex. micolgico directo
- Cultivos

M.O. de escamas tras

aclaramiento con KOH

Toma de
muestra
Estudio
micolgico
directo:
Preparacin de
escamas de piel
con KOH o NaOH

Cultivo

diagnostico

Microsporum canis en agar glucosado

de sabouraud.

Este medio es utilizado para el cultivo de hongos patgenos,

particularmente de aquellos asociados con infecciones de piel. La alta
concentracin de dextrosa y la acidez del pH hacen a ste un medio
selectivo para hongos. Con la adicin de cicloheximida, estreptomicina
y penicilina, se obtiene un excelente medio para el aislamiento
primario de dermatofitos.
En este medio las peptonas proveen la fuente de carbono y nitrgeno
para el crecimiento de los microorganismos, la dextrosa acta como
fuente de energa y el agar es agregado como agente solidificante.
Dextrosa 40.0
Peptona de Casena
5.0
Digerido Pancretico
de Tejido Animal 5.0
Agar Bacteriolgico
15.0
pH 5.6 0.2

DIAGNOSTICO MICOLOGICO

Toma de muestra
Escamas de piel de
reas afectadas.
Faergemann
(1989),
contacto cinta scotch y
azul de metileno 1%.
Colorante de Kane.

Examen directo
Levaduras pequeas o
agrupadas (4 - 8 u )
brotantes, redondas a
ovales, con hifas
septadas, 2.5 a 4 u
dimetro, cortas,
curvas,

AISLAMIENTO - MICOLOGICO

No requiere contacto de placa

Contacto de placas

Cuantitativo.

Medio slido (ASD 2%)con fuente lipdica

(oleico,
araquidnico,esterico,
palmtico,
Tween 80, aceite de oliva), 37 C; pobre a 25
C.
pH 5.5-6.5.
Agar glucosa-Extracto de levadura-Peptona,
aceite
de
oliva,Tween
80
y
glicerol
monoesterico (Gyp-s agar).

 Morfologa colonial
Lisa, crema a marrn amarillento; a menudo
se vuelve secas y ligeramente arrugadas con
el tiempo.

Morfologa microscpica
Levaduras de 1.5-4.5 x 2.0-6.5 u, filides con
pequeos collaretes; redondeadas por un
lado y cortadas bruscamente por el otro,
donde brote con amplia base y sin
constriccin. Hifas usualmente ausentes.

Trichophyton rubrum
- Hongo antropoflico (ms frecuente)
- Afecta pelo, piel (corneo) y uas.
- Medio de cultivo:
sabouraud
glucosado, agar papa dextrosa (PDA)o
CMA, DTM
- Identificacin: perforacin de piel in
vitro. Ureasa positiva (en menos de 4
das), crecimiento no aumenta en
presencia de tiamina e inositol.

Levaduras, cultivadas a
37C

Serolgico

Deteccin de anticuerpos circulantes

especficos: anti - Histoplasma
capsulatum por tcnica de doble difusin

Hongos de importancia en
agricultura y veterinaria.

Diana J.Arenas Machaca

Penicillium
sp.

Fusarium solani

Fusarium

Fusarium

Fusarium graminearu

Coleccin de Cultivo y servicio que ofrece

Qu son las Colecciones de Cultivo?
- Son organizaciones que principalmente se ocupan de guardar
convenientemente cepas de microorganismos,clulas superiores o
diversos materiales biolgicos y los suministran, previa peticin,a
laboratorios microbiolgicos o de biologa celular.

- Son por lo tanto servicios de apoyo a los trabajos de microbiologa

Cundo aparecieron las primeras colecciones de cul

-Kral (Praga, siglo XIX) fue la primera en tener catlogo
-La ms antigua Lobaina (Belgica) (Hongos)
-La ATCC,en 1925.No vinculos directos con la Universidad,es de
carcter comercial (Manassas,USA).
-La CECT,nace en el CSIC(Villanueva)(1960).
-PRCC ,Profesor J.L.Ramos (Pseudomonas putida)

A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacion internacional

denominada World Federation for Culture Collection (WFCC).
En Europa a su vez estan agrupadas en la European Culture Colletion
Organization (ECCO) que se fund en 1982.

Servicios que prestan las Colecciones de Cultivos

1.-Recoleccin,conservacin y suministro de cepas microbianas.
-Recoleccin: Es el servicio mas tpico de una CC.Las
colecciones reunen cepas que les llegan a traves de distintos
conductos,las conservan convenientemente y las suministra
previa peticin.
-Conservacin:
-Suministro: Se hace por correo de superficie,areo o mensajera,pero siempre empaquetado correctamente (tres envueltas)
siempre hay que considerarlo como material potencialmente
patgeno
2.-Recopilacin de datos de las cepas microbianas y difusi de los
mismos
Fichas,ordenadores,redes electronicas,public.de catlogos

3.-Servicio de guardera de las cepas microbianas

Se pueden guardar por encargo cepas microbianas,cobrando
una tasa anual y manteniendo el secreto de este depsito.
4.-Identificaciones microbianas.
5.-Depsito de cepas microbianas.
-Depsito pblico: Cualquier microbilogo puede depositar
una cepa, que considere interesante,en la coleccin. Esta cepa se
incorpora en el catlogo y puede suministrarsela a cualquier otro
microbilogo que la solicite.
-Depsito no pblico:Algunas CC reciben el nombramiento
de Autoridad Internacional de Depsito para fines de patentes,de esta
manera se garantiza la descripcin total y reproduccin del proceso
patentado. Una vez conseguida la patente,la cepa puede suministrarse
previa autorizacin escrita del propietario,aunque no figure en el
catlogo.

Normas generales para la conservacin de

cepas microbianas
Los tres objetivos para una correcta conservacin:
1.-Mantenimiento en Cultivo puro.(PUREZA)
2.-Que este viva.(VIABILIDAD)
3.-La cepa debe guardarse geneticamente estable(ESTABILIDAD)

Lapage en 1977 deca que:

a)
b)

Un cultivo inicial de una especie es una poblacin

Un subcultivo es una poblacin diferente derivada de este
cultivo inicial.
c) Una cepa es una sucecin de subcultivos del cultivo inicial

los datos del cultivo inicial seran los mismos en la cepa?

NO necesariamente porque se producen cambios en los subcultivos
Los mtodos en la conservacin de las cepas microbianas tienen
Como objeto fundamental minimizar estos cambios

La conservacin de
cepas microbianas

Mtodo de eleccin o de conservacin a largo

plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en
agua de mar esteril

Crioprotectores ms
comunes

Glicerol
Dimetilfulfxido (DMSO)
cido glutmico
Glucosa
Sacarosa
Meso inositol
Lactosa
Leche Descremada

Conservacin de microorganismos por

congelacin
La crioconservacin consiste en la conservacin de los
microorganismos a temper.inferiores a cero grados centgrados. Se
basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin
del agua disponible.
Objetivos de la crioconservacin
- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento (-70,-139)
-El estado fisiolgico de la clula (Final f.logartmica)
- Mantenimiento de la estabilidad
- Mantenimiento de la pureza

Conservacin de microorganismos por

congelacin
La crioconservacin consiste en la conservacin de los
microorganismos a temper.inferiores a cero grados centgrados. Se
basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin
del agua disponible.
Objetivos de la crioconservacin
- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento
-El estado fisiolgico de la clula
- Mantenimiento de la estabilidad (fenotpica y genotpica)
- Mantenimiento de la pureza (Hacer alcuotas)

Conclusiones

Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de la

fase logartmica, a la temperatura ptima, en el medio
ms adecuado.
Ajustar el n de clulas a una concentracin final de 26x106 cl/ml. Aadir los crioprotectores adecuados a una
concentracin ptima.
Repartir la suspensin en ampollas de
congelacin,cerrarlas hermeticamente y mantenerlas 30
minutos a 30.
Disminuir la t lo mas rpido posible.
A la hora de recuperar los microorganismos, descongelar
rpidamente, sumergiendo las ampollas con el cultivo
congelado en un bao a 37-40C.

La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a
largo plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar
esteril

FUNDAMENTOS TERICOS DE LA
CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS POR
LIOFILIZACIN

Liofilizacin
Es un mtodo de conservacin a largo
plazo.
Se basa en la paralizacin del
metabolismo celular por falta de
agua:congelacin y sublimacin

PROCESO

Congelar el
agua libre de
las clulas

Eliminacin del agua

Agua congelada

Vapor de agua

Sublimacin

1 Fase de la
Desecacin

2 Fase de la
Desecacin

PROCESO

P
R
O
T
E
C
T
O
R

Congelacin
Rpida
T ambiente,4C,-196C
Tubos marcados

BOMBA
BOMBA

condensador

Sellado al
vacio

Ampolla

Tipos de
Liofilizadores

Liofilizador con
centrifugacin
Se utilizan ampollas de
vidrio taponadas
La suspensin se
centrifuga durante la 1
fase de la desecacin
Se estrechan las
ampollas y,despus de
conectarlas a una bomba
de vaco,se sellan.

Ventajas:Se utiliza la centrifugacin

para que el proceso de congelacin
sea suave y de forma homognea

Liofilizador con estantes

La suspensin se prepara
en viales y,es
precongelada a T muy
bajas antes de aplicar el
vaco.
La segunda etapa de la
desecacin se realiza
tambin en el liofilizador.

Ventajas:La Desecacin es
de manera progresiva y
continuada

Cundo aplicar la
Liofilizacin?
Es un mtodo ampliamente utilizado para conservar distintos
Microorganismos.
SI
-Bacterias,Levaduras,
Hongos,Algunos virus,Algas
Ejemplos:Rhodospirillum,
,Azospirillum,vibrio y dems
bacterias marinas.
-Levaduras miceladas con dificultad en la esporulacin.
-Hongos con grandes conidios o
con dificultad en la esporulacin.

NO
-Dificultad de un crecimiento
Adecuado.
-Microorganismos delicados
que no resisten el paso de
congelacin.
-A tamaos de clulas mayores,
menos efectivo es el proceso
Protozoos,Clulas animales,
Clulas vegetales,Arqueobacterias y bacterias delicadas

FACTORES IMPLICADOS EN LA
CONSERVACIN POR EL PROCESO DE
LIOFILIZACIN

Condiciones de Cultivo
El medio de cultivo
Depender del tipo de microorganismo y sus
requerimientos nutricionales.
Fase de crecimiento del cultivo.
F.exponencial. Suspenciones celulares de 108-109
Clulas/ml en bacterias, algo inferiores en
hongos y levaduras.

Condiciones de incubacin.
T,aerobiosis, anaerobiosis, etc.

FACTORES IMPLICADOS EN LA
CONSERVACIN POR EL PROCESO DE
LIOFILIZACIN
Preparacin de las clulas para su conservacin
Composicin del medio de la suspensin y adecuada densidad
ptica
El medio de la suspensin deber proteger la viabilidad de las clulas. Usar
el crioprotector adecuado en cada caso.
Glucosa 7,5% para Anaerobios
Glucosa 15% para Levaduras.
Glutmico 0,67M para Bacterias Lcticas.
Inositol 5% para Bacterias.
Leche descremada para Levaduras, Hongos y Actinomicetos.
-

Tipos de ampollas,tubos y viales para la liofilizacin.

Dependern del equipo del que se disponga o del tipo de muestra a liofilizar.
Se aconseja que no sean de cristal de pyrex o borosilicato, porque por su
elevada resistencia ofrecern muchas dificultad en su apertura.

FACTORES IMPLICADOS EN LA
CONSERVACIN POR EL PROCESO DE
LIOFILIZACIN
-Temperatura durante la sublimacin.
Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C.
-Grado de deshidratacin alcanzado.
Lo ms alto posible.
-Atmsfera de oxgeno en el tubo.
Las clulas liofilizadas se guardan en tubos al vaco para evitar
Rehidratacin o presencia de gases (como el oxgeno) que pueden
daar las clulas.
-Condiciones de almacenamiento.
La temperatura debe ser constante a 18C y sin bajar de los 0C
y, en oscuridad

LIOFILIZACIN
VENTAJAS
-Reduccin de la
variabilidad del
microorganismo.
-Largo tiempo de
conservacin.
-Aplicabilidad para la
produccin y
distribucin de los
lotes

DESVENTAJAS
-El alto coste inicial del
equipo.
-La preparacin de forma
incorrecta de los
distintos lotes puede
desembocar en un
estancamiento de la
viabilidad y/o en
prdidas en la
estabilidad de los
caracteres de los
microorganismos

La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a
largo plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar
esteril

Conservacin por
transferencia peridica
Es un mtodo en el que los organismos
permanecen activos durante el proceso.
Consiste en la inoculacin de
microorganismos en un medio de cultivo
adecuado,la incubain a una T adecuada
para obtener crecimiento y finalmente el
almacenamiento bajo unas condiciones
adecuadas. El proceso es repetido a
intervalos que garanticen la obtencin de un
cultivo fresco antes de la prdida del viejo.

PARA UNA BUENA

RESIEMBRA PERIDICA

Medio de cultivo.
Temperatura, tiempo y condiciones de
incubacin.
Intervalo entre dos resiembras
Reduccin de la temperatura de
almacenamiento.
Medios no enriquecidos,con limitacin de
nutrientes.
Restriccin de la accesibilidad de aire del
cultivo.

La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a
largo plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de
mar esteril

Conservacin por suspensin

en agua destilada o en agua de
mar esteril
Es un mtodo alternativo muy usado y que da altos porcentajes
de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos
filamentosos como en levaduras y algunas bacterias. Consiste en
Suspender en agua esteril unas cuantas clulas del cultivo que se
quiere conservar. Para los hongos filamentosos que no esporulan,
se puede poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del
Hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se
hace en agua de mar diluida.

La conservacin de
cepas microbianas

Mtodos Restringidos
Desecacin en papel de filtro
Desecacin en suelos,arena
silicagel,etc
Desecacin en bolitas de alginato
Desecacin en sal gorda para
halobacterias

Mtodos de desecacin

Papel de filtro

Paquete
cerrado

Paquetes
semicerrado

Papel
15 minutos
Watman n4
121C

Desecador

Cultivo

P
R
O
T
E
C
T
O
R

Suspensin
celular

Papel con
cultivo
Gotas de
cultivo

2-3 semanas
4C
Cerrado de
Los paquetes

Mtodos de desecacin

20 minutos
121C

Tierra esteril
4C

P
R
O
T
E
C
T
O
R

Cultivo
esporulado

Suelo

4-5das
25C

G
E
R
M
I
N
A
C
I
Agotamiento
de
N

Microorganismos
en fase
durmiente

nutrientes

Almacenamiento
a 18C
Suspensin de
esporas

Mtodos de desecacin

Bolas de Alginato

Gotas

Placa petri con

Papel secante

Alginato 3%
13 minutos
121C
CaCl2 0,03M
esteril
Gotas de alginato
con cultivo
30 minutos
Cultivo Suspensin
en agua esteril

Polimerizacin del
Alginato

Medio de Cultivo Gotas de alginato

0,75M Sacarosa
con cultivo
48horas
DESECACIN

Corriente de aire estr

bomba de vaco a
Temperatura controlad

Prdida del 30% del pe

Gracias por su
paciente atencin