Diagnostico

Molecular II
Microbiologa Clnica
Zaira Sade
Claudio Silva

PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa)

Nos permite obtener un gran nmero de copias de un
fragmento de ADN particular. Tras la amplificacin resulta
mucho ms fcil identificar con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad a
travs de su material gentico.
Etapas: Desnaturalizacin
Alineamiento
Extensin

Tipos de PCR
PCR anidada: el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda
amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de
PCR es muy especfica.
PCR in situ: realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos. consiste en una reaccin de
PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio
de amplificacin.
PCR mltiple: Es un tipo de PCR en el cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin,
en este tipo de PCR se utilizan mltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos, los
amplificados pueden verse como mltiples bandas en un gel. Usada para diagnostico medico.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se aade un componente fluorescente que permite medir la
luz. A ms luz, ms cantidad del ADN detectado.
PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN para detectar moldes de
ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma que utiliza el VIH entre otros virus.

PCR en tiempo real (Q-PCR)

Es una variante de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada
para amplificar y simultneamente cuantificar de forma absoluta el producto de
la amplificacin de cido desoxirribonucleico (ADN).
A la mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluorocromo que, en
un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar
el fluorocromo a la longitud de onda determinada.

Molde de ADN
Par de cebadores especficos
dNTPs (desoxirribonucletidos trifosfato)
Tampn de reaccin adecuado
ADN polimerasa termoestable
Cofactores

PCR en tiempo real (Q-PCR)

Ventajas:
-Amplificacin especifica.
-Automatizacin y disminuye el tiempo de anlisis.
-Ciclos de amplificacin mas rpida.
-especifico, sensible y reproducible.

Los sistemas de emisin de fluorescencia para la

deteccin en Q-PCR pueden ser de dos tipos:

Agentes
Intercalantes

Sondas
marcadas con
fluorocromo

Agentes Intercalantes
Son fluorocromos que aumentan notablemente la emisin
de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hlice. El
ms empleado en PCR a tiempo real es el SYBR Green I.
El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un
aumento proporcional de la fluorescencia emitida.

Sondas marcadas con fluorocromos

Corresponden a secuencias de ADN con dos tipos de
molculas, un donador (fluorforo) y un aceptor
(quencher).
El proceso se basa en la transferencia de energa
fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos
molculas.
Las ms utilizadas son las sondas de hidrlisis,
denominadas tambin sondas TaqMan, las sondas
molecular beacons y las sondas FRET.

1) Sondas TaqMan

Fluorforo (Ej: 6-carboxyfluorescein/ FAM)

Quencher (Ej: tetramethylrhodamine/ TAMRA)

2) Sondas Beacons

3) Sondas FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

RT-PCR (PCR con Transcriptasa

Reversa)
Permite la amplificacin de una cantidad
pequea molculas dianas de RNA (tanto
mRNA como RNA total).
La transcripcin reversa de RNA a cDNA que
posteriormente era amplificado por PCR
tiempo real.
Es usado para cuantificar la expresin de un
gen y estudiar el genoma de los virus de ARN

Extraccin de cidos nucleicos

EXTRACCION MANUAL

EXTRACCION AUTOMATIZADA

1. USO DE FENOL CLOROFORMO PARA

LA EXTRACCION.
2. MULTIPLES MANIPULACIONES
3. MAYOR NUMERO DE MUESTRAS
4. MAYOR CONTAMINACION
5. PERSONAL CALIFICADO
6. CONTROL DE CALIDAD INTENSO

1. EXTRACCION DE ACIDOS MAS

REPRODUCIBLE
2. MENOR MANIPULACION DE LA
MUESTRA
3. EQUIPOS CERRADOS POR LO QUE
EXISTE MENOR GRADO DE
CONTAMINACION
4. MAYOR COSTO DE EQUIPOS

PCR anidada
Variante de la PCR convencional que
comprende dos rondas de amplificacin
con distintos pares de cebadores en cada
una, con el fin de incrementar la
sensibilidad y la especificidad de la
deteccin. Primero se realiza una reaccin
con los cebadores externos para amplificar
una regin de ADN mas extensa, que
contiene el segmento diana. Despus, este
producto de amplificacin se utiliza como
molde de una segunda PCR con los
cebadores internos para amplificar la
regin especfica.

PCR anidada
Mayor especificidad y sensibilidad.
No cuantifica muestra.
Deteccin ADN proviral.

VIRUS

Que son los virus?

Una entidad biolgica infecciosa microscpica, mucho ms pequea que
las clulas a las que infecta. Para reproducirse los virus penetran en las
clulas, insertan su ADN o ARN en el interior de la clula y usan sus
estructuras de sntesis y metabolismos para para fabricar copias del
virus.

Virus
respiratorios

Virus

Virus de la
Hepatitis

Virus del VIH

Carga viral
Cuantificacin de carga viral:
-Pronostico de progresin una enfermedad viral
-Relacionado a replicacin activa del virus
-Expresin en partculas / ml
til en infecciones virales crnicas
Pacientes con trasplante de mdula sea y rganos.
Evala evolucin de infeccin
Monitoreo de efectividad de tratamiento

Virus respiratorios
Infecciones de las vas respiratorias agudas son una causa
importante de morbilidad y mortalidad sobre todo en los
ms jvenes, ancianos y pacientes inmunocomprometidos.
Los virus respiratorios han sido tradicionalmente
identificado por inoculacin en cultivos celulares. (2 a 3
das)
Un problema grandes es la labilidad de estos virus

Influenza A,
B, C

Rous sarcoma virus

(RSV)

Adenovirus

Ms sensible que el cultivo de clulas para la

deteccin de tipo de virus de la influenza A (rango,
45.7% a 121% de aumento)
Tiempo de respuesta para el mtodo de PCR en
tiempo real es slo algunos horas, en comparacin
con 24 a 48 h con tecnologa de cultivo celular
Ms sensible en comparacin con deteccin directa
del antgeno (TestPack)
La sensibilidad de la PCR en tiempo real fue de 23,6%
a 225% mayor que la de los sistemas de cultivo de
clulas

La cuantificacin de ADN de adenovirus sirve para

guiar clnica, intervencin y evaluacin de la
respuesta de los pacientes a la terapia antiviral

Metapneumovir
us

Parainfluenz
a
Sndrome
severo
coronavirus
(SARS-CoV)

Deteccin segura de que este virus puede requerir

largas incubaciones veces (hasta 17 das) despus de
la inoculacin de cultivos celulares
Adems, los efectos citopticos no se detectan en
cualquiera de las clulas hasta 10 a 12 das despus
de la inoculacin
Ensayo de PCR para el diagnstico de laboratorio
de virus de la gripe A y B, RSV, y cuatro
serotipos del virus parainfluenza demostr un
aumento del 30% de estos virus del tracto
respiratorio en comparacin con el cultivo celular
Alto riesgo de las infecciones en el laboratorio
con este virus, se requieren instalaciones de
bioseguridad nivel 3 de laboratorio para la
recuperacin del cultivo celular
El aislamiento del virus era mucho mejor por
pruebas de PCR.

Hepatitis

VHA
VHB
VHC
VHD
VHE

Virus de la Hepatitis
Va de transmisin: Segn su clasificacin
Mtodo de diagnstico: Test cuantitativos de carga viral;
Sondas: SYBR green 1, FRET, TaqMan, balizas
moleculares (Molecular beacon) usados con LightCycler,
ABI PRISM sequence detection system, y Stratagene
Mx4000.

Carga viral
Carga viral VHB:
Una carga viral del VHB superior a 100.000 copias/ml, indicara que el virus est activo
y que tiene muchas posibilidades de causar dao en el hgado.
Una carga viral superior a 10.000 copias/ml, indicara que el virus est activo y que
existe la posibilidad de daar al hgado.
Tratamiento con toda carga.
Carga viral VHC:
La carga viral del VHC a menudo se describe como baja o alta.
Expresada en copias/ml:
Baja: menos de 2 millones de copias
Alta: ms de 2 millones de copias
Si no se encuentra ARN del VHC en una prueba, se dice que la carga viral de la
persona evaluada es indetectable.

VIH

Retroviridae
SIDA VIH
Afecta principalmente el Sistema Inmunolgico (LT CD4)
Tipos: VIH-1 (Grupos, subtipos, intersubtipos); VIH-2
Va de transmisin: Sexual, sangunea y vertical.

VIH-1

VIH-2

Grupo M
Subtipos A, B, C,
D, F, G, H, J, K

2 cadenas de ARN simple de aproximadamente 9,5 kb.

gp41 y gp120 participan en la unin del virus a la celula hospedero
GP de membrana pueden ser utilizadas para otras pruebas no moleculares. (ELISA, Western Blot)

Mtodos de diagnstico

Serologa
Deteccin de antgeno viral
Aislamiento en cultivos
Conteo de LT CD4 (>200 cel)
Identificacin de material gnico (previa aparicin de Ac)
-ADN proviral: PCR Anidada
-ARN viral: PCR en tiempo real
Mtodos PCR: Ms sensibles y especficos
-Recin nacidos
-No seropositivos o indeterminados

Ensayos comerciales para la cuantificacin del

ARN HIV-1 en plasma humano
bDNA Amplificacin de seal por hibridacin molecular:
VERSANT HIV-1 RNA 3.0 ASSAY (Bayer Diagnostics).
NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification)
Amplificacin isotrmica (41C) de ARN: NUCLISENS
HIV-1 RNA QT (bioMerieux).
RT-PCR: AMPLICOR HIV-1 MONITOR (V1.5, COBAS)
(Roche Diagnostics).

Carga viral VIH

Generalmente, una carga viral < 1.000 copias/ml se
considera "baja, con tto.
Generalmente, una carga viral >1.000 copias/ml se
considera "alta con tto genotificacin.
*Depende del mtodo

Correlacin y concordancia de tres tcnicas de

cuantificacin de carga viral del VIH disponibles en
Colombia
La cuantificacin del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) es una
herramienta til para el manejo de los pacientes infectados. Diferentes
tcnicas se encuentran disponibles en Colombia para ese propsito.
Comparar los resultados de carga viral obtenidos mediante el uso de tres
tcnicas de cuantificacin del VIH disponibles en Colombia.
RT-PCR:
Versant bDNA 3.0 (Bayer)
LCx HIV (Abbott)
Amplicor Monitor HIV v1.5 (Roche)

 Light cycler /TaqMan probe HIV-2

5-500.000 copias/ml
160; 89 bp fragment of gag gene

Resultados
Los resultados obtenidos con las tres
tcnicas fueron comparados entre s
mediante regresin lineal.

1.
2.
3.

Amplicor HIV-1
-400-750.000 copias/ml
RT-PCR real time (Roche)
- COBAS TaqMan,
FRET, Beacons
Light cycler /TaqMan probe HIV-2
5-500.000 copias/ml
160; 89 bp fragment of gag gene

Conclusin
El estudio indica que las tres tcnicas de cuantificacin
de carga viral son adecuadas, estas presentan un alto
nivel de correlacin y concordancia, por lo tanto
permite la utilizacin clnica de cualquiera de ellas.
Sin embargo, la variabilidad observada, hace
necesaria la utilizacin del mismo mtodo de
cuantificacin de la carga viral para la toma de
decisiones clnicas en el seguimiento de los pacientes
a travs del tiempo o para establecer el nuevo valor de
base con la tcnica a instaurar.

Caso clnico
Una mujer embarazada rompe aguas espontneamente a las 36
semanas de embarazo. Dos das despus del parto, el neonato
presenta fiebre, llora y se muestra inquieto. Se toma una muestra de
sangre para hemocultivo.
Qu cantidad de sangre extraera Ud.?
Tras 48 de incubacin a 37C, se observ crecimiento bacteriano.
Los subcultivos en agar sangre mostraron colonias pequeas betahemolticas (acotadas), resistentes a bacitracina (0,04 U) y test de
CAMP+ en punta de flecha.

 Cul es el microorganismo ms probable que causa esta

enfermedad?
Cul es el modo ms probable en que se ha producido el contagio
del neonato?