SECUENCIACIN

AUTOMTICA

Integrantes:

Del Cid Ariadna

Montero Kathia
Rivera Monique

INTRODUCCIN

Cada nucletido est formado por un azcar: la

desoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser de
cuatro tipos diferentes: adenina (A), guanina (G), citosina
(C) y timina (T) y un grupo fosfato.
La estructura de un determinado ADN est definida por la
ordenacin o "secuencia" de las bases nitrogenadas en
la cadena de polinucletidos, residiendo precisamente en
esta secuencia de bases la informacin gentica del
ADN.
La estructura en doble hlice del ADN, con el
apareamiento de bases limitado (A-T; G-C), implica que
el orden o secuencia de bases de una de las cadenas
determina automticamente el orden de la otra, por ello
se dice que las cadenas son complementarias.

SECUENCIACIN DE ADN

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Mtodos clsicos de secuenciacin

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

Mtodo enzimtico de Sanger
Secuenciacin automtica empleando el mtodo enzimtico

Secuenciacin con cebadores fluorescentes

Secuenciacin con terminadores fluorescentes
Secuenciadores automticos

Secuenciadores capilares
Secuenciadores en geles desnaturalizantes
Equipamiento

Secuenciador en geles ABI 377

Modo operativo: Preparacin de las muestras.

Otros mtodos de secuenciacin automtica de ADN

Secuenciacin de ADN empleando microarrays
Pirosecuenciacin

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" ya no es

una limitacin en la investigacin en Biologa Molecular, ni en
los procedimientos de diagnstico basados en el estudio del
ADN. El nmero de aplicaciones de esta tcnica parecen
infinitas, y continan creciendo sin parar. Una de sus posibles
aplicaciones se centra en la secuenciacin del ADN de
muestras biolgicas.
Investigacin
forense
Estudios de
identidad y filiacin

Diagnstico
de genes
PCR

Diagnstico de
enfermedades
hereditarias y cncer

Mutagnesis
dirigida

Aislamiento
de genes

MTODOS CLSICOS DE
SECUENCIACIN

Los dos protocolos clsicos de secuenciacin (mtodo

qumico y enzimtico) comparten etapas comunes.
Marcado: Es necesario marcar las molculas a secuenciar
radiactiva
o
fluorescentemente
Separacin: Cada protocolo genera una serie de cadenas
sencillas de ADN marcadas cuyos tamaos se diferencian en
una nica base. Estas cadenas de distintas longitudes
pueden
separarse
por electroforesis en
geles desnaturalizantes de
acrilamida-bisacrilamida-urea,
donde aparecen como una escalera de bandas cuya longitud
vara en un nico nucletido.

Para obtener estas cadenas

se emplean dos procedimientos:

MTODO QUMICO DE MAXAM Y

GILBERT
Esta tcnica consiste en romper cadenas de ADN de
cadena sencilla marcadas radiactivamente con
reacciones qumicas especficas para cada una de las
cuatro bases.
Los productos de estas cuatro
reacciones se
resuelven, por electroforsis,
en funcin de su tamao en
geles de poliacrilamida donde
la secuencia puede leerse
en base al patrn de bandas
radiactivas obtenidas.

MTODO ENZIMTICO DE
SANGER

Para este mtodo resulta esencial disponer de un

ADN de cadena simple(molde) y un iniciador,
cebadoro "primer" complementario de una regin

del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la

secuencia.
Este cebador se utiliza como
sustrato de la enzima ADN
polimerasa I que va a
extender la cadena
copiando de forma
complementaria el molde
de ADN.

SECUENCIACIN AUTOMTICA
EMPLEANDO EL METODO ENZIMTICO

Es una alternativa al mtodo de Sanger. Consiste

en marcar el oligo cebador o los terminadores con
un compuesto fluorescente y activar la reaccin
de secuencia. Los productos de la reaccin se
detectan directamente durante la electroforsis al
pasar por delante de un lser que al excitar los
fluorforos permite detectar la fluorescencia
emitida.

SECUENCIACIN EMPLEANDO CEBADORES

FLUORESCENTES

Se realizan cuatro
reacciones de secuencia
distintas en cada una de
las cuales se aade el
oligonucletido o cebador
marcado con una sonda
fluorescente distinta y un
ddNTP diferente en cada
una de ellas. Al finalizar
las cuatro reacciones se
mezclan en un nico tubo

SECUENCIACIN EMPLEANDO
TERMINADORES
FLUORESCENTES

Se realiza una nica reaccin de secuencia en presencia

de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con
una sonda fluorescente distinta.
De modo alternativo, la secuenciacin puede llevarse a
cabo empleando terminadores marcados cada uno con un
fluorforo diferente. Esta qumica es mas sencilla porque
permite llevar a cabo la reaccin en un solo tubo, en que
se aaden los cuatro terminadores marcados.

SECUENCIADORES AUTOMTICOS
Secuenciadores automticos capilares
Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan
una alternativa clara al sistema basado en geles de
acrilamida/bisacrilamida donde este soporte ha sido sustituido
por un polmero que se inyecta de forma automtica en un

capilar antes de cargar la muestra de

secuenciacin; las muestras se van
analizando una a una. Este tipo de
secuenciadores se utiliza para lecturas
no superiores a unos 450pb.

SECUENCIACIN AUTOMTICA EN GELES

DESNATURALIZANTES DE ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA

La
secuenciacin
automtica
mediante
geles
desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de
acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados
adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para
los mismos y que posteriormente se acoplar en el
secuenciador automtico para proceder a la carga de la
muestras.
La
secuenciacin
automtica
mediante geles desnaturalizantes, se
realiza polimerizando un gel de
acrilamida/bis entre dos cristales
montados adecuadamente sobre el
cassette que sirve de soporte para los
mismos y que posteriormente se
acopla en el secuenciador automtico
para proceder a la carga de la
muestras.

EQUIPAMIENTO

Secuenciador automtico ABI 377

Introducir en un tubo de PCR la muestra de ADN de doble cadena, el

primer a utilizar y la mezcla de reaccin
Programar la reaccin de PCR (multiplicacin del ADN) sometiendo la
mezcla anterior a 25 ciclos de las siguientes caractersticas: 30s a 94C
(desnaturalizacin), 15s a 45C (anillamiento) y 4min. a 60C (elongacin).
Enfriar el tubo a 4C
Purificar el resultado de la reaccin de secuencia de PCR, en una
solucin de etanol y cloruro magnsico: dejar precipitar la mezcla,
centrifugar y eliminar por aspiracin el etanol.
Resuspender el resultado de la reaccin de PCR en un pequeo volumen
de formamida: azul de dextrano.
Desnaturalizar la muestra calentndola durnte 2 min. a 90C. Enfriar en
hielo.
Cargar los fragmentos de ADN fluorescentes en el gel de secuencia.

OTROS MTODOS DE SECUENCIACIN

AUTOMTICA

Secuenciacin de ADN empleando microarrays

Principio:

Existen muchas variedades de microarrays o ADN-chips como

tambin se les denomina. Bsicamente un microarray consiste
en una matriz de "pocillos microminiaturizados sobre un
substrato de vidrio en donde se
implantan, utilizando diversas tcnicas, cadenas simples de
oligonucletidos.
El poder adherir una cadena corta de oligo
Sobre una superficie plana es decisivo en el diseo de los
microarrays.

Dado que conocemos la secuencia y distribucin

de los oligonucletidos en el microarray podemos,
al excitar el microarrray con un laser y estar las
cadenas hibridadas fluorescentemente, conocer la
ubicacin de las cadenas de las mismas y su
secuencia.

Visualizacin tpica de una secuenciacin mediante microarrays

Pirosecuenciacin
Se trata de un mtodo simple y consistente, til para la
secuenciacin de fragmentos de ADN de tamaos
pequeos o medianos.
Etapas del proceso:
Un cebador especfico se une a una cadena de ADN
sencilla en presencia de dNTPS, ADN polimerasa, ATP
sulfurilasa, luciferasa y apirasa as como de los
sustratos APS (adenosina 5 fosfosulfato) y luciferina.
El primero de los cuatro dNTPs se aade a la reaccin.
La ADN polimerasa cataliza su incorporacin a la
cadena; si este dNTP es complementario de la
secuencia del ADN molde se libera PPi en una cantidad
equimolar a la cantidad de nucletido incorporado.

APLICACIONES DE LA SECUENCIACIN DE
ADN

Deteccin de mutaciones
Secuenciacin de ADNs fsiles
Diagnstico de enfermedades genticas
Identificacin de especies y control de cruces
entre animales
Proyecto genoma humano

PROYECTO GENOMA HUMANO

El Proyecto Genoma Humano es un proyecto

internacional cuyo objetivo final es obtener una
descripcin completa del genoma humano a travs
de la secuenciacin del ADN. El genoma que se
investiga es el genoma nuclear.

Desde su inicio, el proyecto ha

sido justificado especialmente por los
beneficios mdicos que se espera
obtener del conocimiento de la
estructura de cada gen humano.