siRNAs y miRNAs

mRNA
Kim, 2005
miR172
A. thaliana miRNA genes

Xie et al, 2005

 20-75 nts

21-nts 21-nts

Prediction criteria candidates known

possible hairpin structure 312,236 19
GC: 38-70%; hairpin: 20-75 nts 79,938 15
Homologs in Oryza genome 6,098 12
Secondary structure (mfold) 326 12
Eliminate other no-coding RNAs 95 12
 miRNA cloning

Ligation of linkers
5’adapter 3’adapter
miRNA-OH
P-

20
miRNA RT-PCR
3’RT primer

5’ primer

Cloning

Sebastien Pfeffer and Tom Tuschl, RU

Biogénesis
Dicer and TAR RNA-binding protein (TRBP)
interactions during RNA interference
Janice L. Pellino and Erik J. Sontheimer
Cell 115, 2003
GW182
 miRNAs y siRNAs

Biogénesis parcialmente compartida

Mecanismo de acción
Naturaleza química

Origen: gen independiente vs. RNA exógeno

Estructura del precursor: hairpin vs. dsRNA

RNAs producidos: uno vs. varios

RNA blanco: hetero- vs. auto-silenciamiento

Los mRNAs blanco de miRNAs
 MYB101 y MYB33 son blanco de miR159

A
MYB101 5’ UAGAGCUUCCUUCAA CCAAA 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’

U
MYB33 5’ UGGAGCUCCCUUCA UCCAAG 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’
0 dias 1 dia 2 dias

Germinación en ABA 3.0M

identificación de miRNAs
 Clonación de miRNAs

nt Oligo 5’ Oligo 3’ Ligación de

50
40
miRNA-OH
P- adaptadores
30
20

miRNA RT-PCR

3’RT primer

5’ primer

Clonación

Sebastien Pfeffer y Tom Tuschl, RU

 miR159 se induce por ABA y sequía

-ABA +ABA
0 24 48 0 2 4 8 12 24 48 t (hr)

- miR159
1.0 0.9 0.3 1.0 2.1 5.1 4.1 2.7 2.2 3.3

- 5S rRNA

miR159
Cómo identificamos los blancos?
 …y los mRNAs blanco?

MYB101 mRNA

UAGAGCUUCCUUCAAACCAAA
|||||||:||||||| ||||| A
miR159a 3’AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’ AA

UAGAGCUUCCU

UCAAACCAAA
A
AA
 5’RACE

G
OH RNA degradado
mRNA

P
RNA cortado + rRNA

linker RNA

5’RACE RT-PCR primers

bp M PCR

1000
500
300

100
miR159 regula los mRNAs de MYB101 y MYB33

5’RACE

A
MYB101 5’ UAGAGCUUCCUUCAA CCAAA 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’

5’RACE
U
MYB 33 5’ UGGAGCUCCCUUCA UCCAAG 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’
Cómo funciona miR159 en respuesta a ABA?

señal (ABA)

miRNA

mRNA blanco

respuesta (detener crecimiento)

 plantas animales

(acuérdate del paréntesis cultural!)

 miR124 miR1

Transfección de cel. HeLa

microarreglos
Supresores virales!
Genes HOX en Mamíferos y Drosophila
Como funcionan los miRNAs en Plantas?

3 Uso de miRNAs como herramienta de análisis

en plantas
señal

miRNA miRNAs artificiales

mRNA blanco

respuesta

miR159 y miR169: modificados para regular distintos mRNAs

 Diseño de un miRNA para PDS

miR159a 5’ UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA 3’

miR-PDS159 5’ UUUGGAAAUAUGGGAUCUCUU 3’

miR159a factores tipo MYB

miR-PDS159 PDS

PDS mRNA 5’ AAGAGAUCCCAUAUUUCCAAA

3’
|||||||||||||||||||||
miR-PDS 3’ UUCUCUAGGGUAUAAAGGUUU 5’
 miR-PDS159 se expresa en N. benthamiana

miR159a 5’ UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA
3’

miR-PDS159 5’ UUUGGAAAUAUGGGAUCUCUU
vector miR-PDS
3’
1 2 3 1 2 3 dpi
40
30

miR-PDS 20
miRNA*
5’

miR-PDS* 3’
miRNA

miR159
 miRNAs artificiales

La secuencia del miRNA puede cambiarse (casi) completamente

Flexibilidad en el sitio de corte

Sitio único en el mRNA

Secuencia común en varios mRNAs blanco (*)

Corte en sólo un miembro de una familia multigénica (#)

#
A *
B

C
miR159 regula negativamente la respuesta a ABA

Col-0 100 Ler

100
HC-Pro
35S:miR159a
80 80
n

60 60

40 40
% germinación % germinació

20 20

0 0
0.0 0.5 1.0 3.0 5.0 0.25 0.5 1.0
ABA [µM] ABA [µM]

V.Vance, USC N.Harberd, John Innes Centre

ABA Respuesta a ABA

(detener crecimiento)
miR159

HC/Pro
Mutaciones en MYB101 para generar un mRNA resistente

A
MYB101 5’ UAGAGCUUCCUUCAA CCAAA 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’

AAGU A
MYB101AAGU 5’ UAGAGCUUCC A CCAAA 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’
La sobreexpresión de un mMYB101 resulta en
hipersensibilidad a ABA
100

90

80

70

60
WT
50

40

30
% germination (7dag)
20

10

0
AAGU
Col-0
(WT)
(AAGU)
0.5µM ABA pBA-MYB101pBA-MYB101

ABA MYB101 Respuesta a ABA

(detener crecimiento)
 Conclusiones

MYB33
ABA MYB101 Respuesta a ABA
(detener crecimiento)
miR159

• miR159 se induce por ABA durante germinación y regula los

mensajeros de MYB33 y MYB101

• MYB33 y MYB101 son reguladores positivos de la respuesta a ABA

• miR159 desensibiliza la señal de ABA através de la degradación

del mRNA de factores positivos