BIOLOGIA MOLECULAR

MICROARRAYS
Y
PCR (A tiempo real)
Docente: Minaya Galarreta Angelica
Integrantes:
Mallma Quinteros Juan Carlos
Santos Zavala Percy Joel
Sernaque Ramirez Milagros
Caillahua Aquino Yanet Giovana

INTRODUCCION
La tecnologa de microarrays de ADN nos permite realizar anlisis genticos sobre miles
de genes en forma simultanea .

La gran variedad observada en los experimentos y su costo elevado nos exigen un

diseo estrictamente cuidadoso .

En esta revisin se explicara que es un microarray de ADNc , como funciona y cuales

son sus principales usos .

 Que es un microarrays ?
Es una herramienta que permite realizar anlisis genticos diversos basados en la
miniaturizacin de procesos biolgicos .

La primera aplicacin de esta tecnologa fue para medir simultneamente el nivel de

expresin de miles de genes .

Ventajas:
Permiten analizar o estudiar al mismo tiempo la expresin y comportamiento de todos los
genes de un mismo organismo.
Es econmico.

Desventajas:
No es posible estudiar a profundidad cada gen.
Posibilidad de contaminacin.

USOS DE LOS MICROARRAYS DE EXPRESION

El objetivo principal para el uso del microarrays es la expresin gentica, es
decir como se expresan los genes de un tejido mediante la fluorescencia.
como bien sabemos que el ARN es muy inestable y se degrada fcilmente en
pocos minutos es por eso que estas muestras deben ser congeladas y frescas

Tipos de microarrays:
1-Microarrays de ADNc.
2-Microarrays de Oligonucletidos.
3-Microarrays de Protenas.
4-Microarrys de Tejidos.

MICROARRYS DE ADNc:
Se basa en la comparacin de 2 muestras biolgicas diferentes.

Pasos a realizar en un procedimiento de un microarrys de ADNc , son 5:

1Extracion del ARN.

Procurar que el ADN sea muy concentrado y puro.

2Marcado del ARN y Sntesis de ADNc.

Colocar ambas muestras a comparar en tubos diferentes , a cada enzima agregarle desoxinucleotidos (A,G,C,T) y
la enzima transcriptasa inversa para sintetizar el ADNc , a un tubo se le agrega fluoruro rojo y al otro verde.

3 Impresin de microarreglos

Es la ubicacin de las muestras sobre el chip , este procedimiento

solo realiza utilizando robots debido a su precisin.

4 Hibridacin del ADNc

La hibridacin se realiza sobre el chip de ADN ,

la hibridacin es la unin de las cadenas
de ambas muestras .

5 Lectura de microarreglos

Excitacin de los fluorescentes e interpretacin de resultados.

Se excitan los fluorescentes con lseres rojos y

verdes para que emitan coloracin y
posteriormente poder analizar los resultados.

Los puntos que van de tonalidades rojas a

naranjas indica un aumento en la expresin del gen.

Los puntos que van de tonalidades verdes a verdes claras

indica una disminucin en la expresin del gen.

Los puntos que son totalmente amarillos indican que en

ambas condiciones el gen se expresa igual.

Para que sirven los microarrys de ADN ?

Para estudios de diagnostico y caracterizacin de tumores u otros tejidos.

Diagnostico de enfermedades infecciosas .

Para detectar mutaciones en los genes.

Para detectar nuevos oncogenes y genes supresores de tumores.

Microarrays de DNA
Los microarraysde DNA surgen de la necesidad
de analizar la cantidad de informacin
procedente de los grandes proyectos de
secuenciacin de genomas.
Permiten elaborar mapas finos de transcripcin
y proporcionan informacin indirecta de los
niveles de protenas.

Microarraysde DNA
El anlisis de microarrays de DNA es una nueva
tecnologa que permite estudiar simultneamente la
expresin de miles de genes y analizar su expresin
bajo distintas condiciones experimentales.
Los microarrays de DNA constan de miles de
conjuntos ordenados de molculas de DNA de
secuencia conocida depositados en un soporte slido
(~2 cm2) como cristal, nylon o silicio.
Cada combinacin (gen/muestra) se localiza de forma
inequvoca en un punto del microarray.

Microarrays de DNA
Los microarrays de DNA permiten la medida
simultnea de los niveles de expresin de miles de
genes (sondas)en un solo experimento de hibridacin
con una mezcla compleja de DNA o RNA (dianas).
Sondas: secuencias de DNA conocidas
(oligonucletidos productos de PCR) inmovilizadas
ordenadamente sobre una superficie slida.
Dianas: muestra problema de DNA o RNA marcada
cuya abundancia ser determinada por hibridacin.

Microarrays de DNA
Concepto Bsico del Microarrays:
Medir el nivel de transcritos (mRNA) de un gran nmero
de genes simultneamente para determinar que genes
se estn expresando en la clula.

Microarrays de DNA Sondas

Cada sonda del microarray de DNA est diseada para
unirse a un gen de forma especfica.
Diseo de sondas especficas:
Especificidad de secuencia.
Tms homogneas.
Sin estructuras secundarias.
Cada sonda est dispuesta de forma ordenada sobre el
microarray de DNA.

Microarrays de DNA
El Resultado
Los microarrays de DNA estn formados por 100 -1 milln
de sondas de DNA sobre una superficie de 1 cm por 1 cm
(chip de DNA).
Los resultados de microarrays de DNA se basan en el
concepto de culpable por asociacin.
Genes que son co-regulados(patrn similar de
comportamiento) es probable que estn funcionalmente
relacionados formando parte del mismo proceso biolgico.

Microarrays de DNA
Cual seria el reto?
Los microarrays de DNA son una revolucin por su
capacidad de realizar experimentos inconcebibles
hasta hace poco tiempo.
Los nuevos chips de DNA podrn contener (y por tanto
estudiar) el genoma humano en 2 cm2.
Esto genera cantidades ingentes de datos que deben
ser almacenadas, procesadas y analizadas:
-Al tratarse de una nueva tcnica la mayor parte de
mtodos, protocolos o estndares se estn an
definiendo.

Microarrays de DNA
El Experimento Bsico
Un experimento bsico de microarrays de DNA consiste en:
1-Diseo y fabricacin del microarray.
2-Preparacin de la muestra e hibridacin.
3-Escaneo del microarray.
4-Anlisis de imagen.
5-Anlisis de los resultados.

Preparacin de la muestra
Paralelamente al diseo y fabricacin del microarray
que contiene los genes (sondas) cuya expresin se desea
estudiar...
...deben prepararse las muestras problema (dianas) en
las que se desea estudiar la expresin de estos genes.
Extraccin de todo el mRNA de las clulas en las
condiciones que se desea estudiar, y posterior marcaje
del mRNA.

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Hibridacin
Una vez preparadas y marcadas las muestras problema
(dianas) se depositan sobre las sondas en el microarray de
DNA.
Esto har que los cDNAs o cRNAs de las muestras problema
se puedan hibridar con los de cada gen contenido en las
sondas del microarray de DNA.
La hibridacin tendr lugar en un grado proporcional a la
expresin del gen de cada sonda en cada muestra problema.

Hibridacin
En arrays de cDNA las muestras problema se juntan y se
hibridan en un nico microarray.
En arrays de oligonucletidos las muestras se hibridan
por separado en dos microarrays idnticos.
Tras la hibridacin, el microarray se lava para eliminar el
material que no se ha hibridado.
La intensidad de la seal de hibridacin resultante es
proporcional a la cantidad de mRNA que corresponde a
esa secuencia en la muestra original.

Hibridacin
La deteccin de la hibridacin es un paso clave para
determinar qu sondas se han unido a sus dianas
complementarias procedentes de la muestra.
Las principales tcnicas de deteccin de la hibridacin
requieren del marcaje previo de las dianas:
cDNA: Stanford Microarrays.
cRNA: Affymetrix.

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Stanford microarraysImpresin robtica

Tamao del lunar: 100-300 m ()
Espaciado: 150-300 m
Nmero lunares I. mecnica:250-1000 lunares/cm2
Nmero lunares Ink-jet:>2500 lunares/cm2
Cantidad DNA:<10 pg DNA
Tipo de substrato: Portas recubiertos (polylisina, silano,
superaldehido, estreptavidina) Membrana de nylon

Stanford microarrays Marcaje dianas (cDNA)

Fluorescencia(Cyanine 3 vs. Cyanine 5)
Radioactividad(3H vs. 35S o 33P vs. 14C)
Los dos marcajes ms comunes son los fluorocromos de
cianina:
Cy3, absorcin 554 nm, emisin568 nm
Cy5, absorcin 650 nm, emisin672 nm
Pero tambin se utilizan fluorocromos Alexa:
Alexa Fluor 546
Alexa Fluor 647

Stanford Microarrays Impresin Robotica

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La Tecnologa Affymetrix -Sondas

Arrays de oligonucletidos: sntesis in situ de oligonucletidos
de 25 bases sobre una superficie cuadrada de cristal (1.3 cm x
1.3 cm) mediante fotolitografa.
11-20 parejas de sondas especficas para cada gen.
Sobre representacin extremos 3de los mRNA.
Seleccionadas para maximizar las temperaturas de hibridacin
y la especificidad.

La Tecnologa Affymetrix -Sondas

Tamao del lunar: ~150 m ().
Densidad: 10.000-250.000 oligonucletidos/cm2.
Millones de copias de cada oligonucletido especfico (107108copias).
Un array de oligonucletidos puede contener 400.000 sondas
(aproximadamente 20.000 genes).
El array de S. cerevisae contiene 6.000 oligos, que representan
todos sus genes conocidos.

La Tecnologa Affymetrix -Sondas

Para cada gen existen dos sondas: una de homologa
perfecta (PM, Perfect Match) de 25 bases y otra con una
error deliberado/mutacin (MM, MisMatch) en la zona
central.
Buena calidad de datos/ baja varianza.
La presencia de numerosos genes de control permite una
casi perfecta normalizacin entre diferentes experimentos.

Microarrays de DNA -Comparativa

Stanford microarrays:
Flexible, tambin especies sin secuenciar
Requiere menor presupuesto
Calidad de datos: media-alta
Affymetrix:
No flexible, slo especies secuenciadas
Equipamiento caro
Calidad de datos: alta

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Anlisis de imagen

Esta nueva forma de experimentar requiere de nuevas

herramientas de anlisis y visualizacin de resultados.
Cada experimento de microarrays de DNA genera una
gran cantidad de datos y es preciso realizar un
procesamiento apropiado de los mismos.
Transformacin de las imgenes en nmeros.

Anlisis de imagen
Escaneado
-Escner Confocal
-Escner CCD
Formatos archivos imagen
Anlisis de imagen
-Localizacin de los puntos
-Segmentacin de los puntos
-Evaluacin calidad de los datos

Los escner generan un archivo grfico y el formato de archivo de imagen

ms comunes TIFF de 16 bits.
Un archivo TIFF de 16 bits describe cada pixel en una imagen con una
intensidad entre0 y 65535.
Normalmente dos escner en diferentes longitudes de onda originan dos
archivos monocromos que se superponen.

Anlisis de imagenFormato archivos imagen

DOS COLORES Muestra1
marcada en rojo(Cy5) Muestra2
marcada en verde(Cy3)
Rojo: gen inducido en Muestra1
Verde: gen inducido en
Muestra2 Amarillo:-niveles
similares de expresin
Rojo/Verde: ratio de expresin
UN COLOR La intensidad de la
expresin de un gen utilizando
las sondas(PM) (en algunos
casos MM-control)
Los archivos grficos generados
por el escneres analizan
mediante diferentes programas
informticos

Anlisis de imagenLocalizacin de los puntos

La identificacin y cuantificacin de las seales de hibridacin(puntos)
puede realizarse de forma manual, automtica y semiautomtica.
Se dibuja una parrilla sobre la imagen para ayudar al programa en la
identificacin de puntos individuales.

Anlisis de imagenEvaluacin calidad de los datos

La mayor parte de las
irregularidades se pueden
detectar por las siguientes
medidas:
Variabilidad de la
intensidad Desviacin del
tamao de punto
Desviacin de la
circularidad Intensidad de
seal relativa al fondo
Desviacin de la posicin
en la parrilla
Anlisis de imagen
Evaluacin calidad de los
datos
En base a estas medidas,
se pueden descartar
puntos irregulares.

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Normalizacin
En general, los niveles de expresin de genes individuales
se miden por:
log (R/G)
log (PM/MM)
En cualquier experimento biolgico es esencial conocer el
grado de reproducibilidad de las medidas.
La repeticin de experimentos de microarrays es costosa.
El factor limitante puede ser la cantidad de muestra
biolgica.

Normalizacin
Pre-procesamiento de datos iniciales previo al anlisis estadstico y
anlisis avanzado de los datos.
Cada valor de intensidad proviene de una imagen independiente y es
necesario hacer que estos valores sean comparables. Ajuste bsico:
igualar la intensidad media de las imgenes.
Las intensidades no son nicamente concentraciones de mRNA, hay
mltiples fuentes de variacin que pueden afectar y desviar
seriamente la interpretacin de los resultados.

Normalizacin Fuentes de variacin

Contaminacin

de tejidos

Degradacin
Purificacin RNA
Transcripcin reversa
Eficiencia de amplificacin
Eficiencia de marcaje (Cy3/Cy5)
Soporte unin DNA
Spotting
Otros temas relacionados con la preparacin
del array
Correccin del fondo
Segmentacin de la imagen
Eficiencia y especificidad de hibridacin
Efectos espaciales

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Anlisis Estadstico
Prcticamente cualquier tcnica estadstica tiene cabida en los
estudios de microarrays de DNA.
La tcnica de agrupamiento de datos ms popular es el anlisis de
conglomerados:
A partir de la matriz de datos de expresin gnica.
Busca formar grupos naturales (conglomerados o clusters)
de genes o de condiciones experimentales que permitan responder
las preguntas del estudio.

Anlisis Estadstico
El anlisis de
conglomerados
permite visualizar
aquellos genes
cuyos perfiles de
expresin son ms
similares.
Para facilitar la
visualizacin los
nmeros vuelven a
convertirse en
colores.

Anlisis estadstico
Otra forma usual de
representar los
datos es a travs de
un grfico que
muestre como varia
la expresin del gen
entre los distintos
experimentos.

TRATAMIENTO DE VALORES
PERDIDOS

Cuando se lleva acabo el anlisis de datos de microrrays

puede ser importante tomar en cuenta el planteamiento
de un tratamiento adecuado a los valores perdidos.

Trabajar con los puntos con informacin completa en

todos los microrrays puede suponer una perdida
significativa de genes valorables.

A menudo se emplean tcnicas de imputacin (sustitucin

de datos) basadas en medidas condicionales del gen
respecto al conjunto de los microrrays o respecto a los
valores de los putos vecinos.

Anlisis de la diferencias
de expresin a nivel de
ARN
Este apartado del anlisis pretende determinar
qu genes varan su nivel de expresin
en funcin del tejido analizado (ejemplo, Normal y tumor).

El objetivo de la tecnologa de microarrays de expresin consiste en cuantificar la

abundancia de miles de secuencias de ARNm (asociadas a los genes y fragmentos de
genes) de una muestra biolgica y determinar si existen diferencias en miles de
variables (genes).

Muestra de los pasos de

un experimento de
anlisis de la expresin
gentica con microarrays
de expresin. En este
apartado se revisan los
dos primeros pasos,
relacionados con el diseo
y elaboracin del
experimento de
hibridacin del
microarray.

Por otra parte la tasa o nivel de resultados falsamente positivos puede ser muy
elevada si no se emplean correcciones que tengan en cuenta mltiples hiptesis que
se aprueban.
Las soluciones propuestas para estos problemas son emplear tests de permutaciones
para evaluar empricamente el nivel de significacin par cada gen y luego controlar la
tasa global de resultados falsos positivos teniendo en cuenta las diversas
comparaciones entre las variables (genes).
TEST DE BONFERRONI: Consiste en considerar significativos slo aquellos valores p
inferiores al cociente entre alfa y el nmero de tets.
Otros test de control del nivel global de significacin emplean procedimientos
adaptados y toman en cuenta la correlacin entre tests. Tambin es usual usar
mtodos de remuestreo.

CLASIFICACIN DE
MUESTRAS O GENES
A partir de los genes que muestren su expresin diferencial se podr realizar una
clasificacin de muestras y las cuales despus de agrupadas se podrn observar sus
caractersticas y as poder identificar Genes de Prototipo y para poder clasificarlos.

Existen diversos mtodos de clasificacin automtica, los ms usados se basan en

tcnicas de conglomerados o Clusternig jerrquicos, que pueden emplear distancias y
algoritmos.

CONGLOMERADOS O
CLUSTERNIG

Los Conglomerados o clustering es el mtodo ms extendido de aprendizaje no

supervisado.
Podemos definir el clustering como una tcnica para dividir un conjunto de datos
en grupos de objetos similares. En cada grupo, tambin denominado cluster, se
incluirn objetos similares entre s y distintos de los objetos de otros grupos. El
objetivo es maximizar la similitud entre los elementos de un grupo y minimizar la
similitud entre los distintos grupos. De esta forma, el objetivo del clustering es
encontrar estructuras intrnsecas a un conjunto de objetos.

Los Logaritmos de Clustering se pueden clasificar segn a los distintos criterios que atienden:

Exclusivos o no exclusivos:
Estos algoritmos de clustering exclusivos agrupan los objetos de forma exclusiva, es decir, si
un objeto se asigna a un grupo, no puede ser asignado a ningn otro grupo. Por otro lado.
Los algoritmos de clustering no exclusivos permiten que un mismo objeto sea asignado a ms
de un grupo, por lo que los grupos pueden solaparse.

Jerrquicos o particionales:
Estos algoritmos unen, paso a paso, grupos ya formados, o bien dividen grupos en otros de menor
tamao. De este modo, un algoritmo de clustering jerrquico genera una secuencia
de grupos unidos.

DISCUSIN O
CONCLUSIONES

Los microrrays para anlisis genticos se estn abriendo un gran campo logrndose consolidar y
posicionar como una tecnologa til, a pesar que es muy reciente su implementacin y todava
carece de limitaciones tcnicas como una gran variable.

El mbito que ah recibido y aplicado con mayor nfasis y entusiasmo esta nueva tecnologa en
el rea oncolgica, donde ella se han publicado y registrado interesantes resultados en cuanto
a clasificacin molecular y prediccin de pronsticos en varios tumores.

Por el momento los microrrays se utilizan solo en el mbito de la investigacin, pero dentro de
un tiempo se espera a que aparezcan aplicaciones clnicas para diagnostico y evaluaciones de
riesgo.