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Mtodo de Sanger
Luiz Claudio Santana da Silva
Maira Cicero Ferreira
Histrico
1975:
primeira
sequenciamento.
descrio
do
dNTPs
ddNTPS
ddNTPS
Atkinson
mostrou
a
atividade
inibitria
do
ddTTP
(23
dideoxitimidina trifosfato).
Aps a incorporao do ddTTP ocorre
a inibio da sntese da cadeia.
Metodologia
Desnaturao do DNA de dupla fita.
Metodologia
Usam-se baixas concentraes de
ddNTPs e altas concentraes de
dNTPs.
Em cada reao, um ddNTP
incorporado aleatoriamente ao invs
do dNTP correspondente, provocando
a terminao da polimerizao.
Sanger, Coulson, 1975.
32
32
desnaturante
P
de
Leitura
Aps autoradiografia a ordem dos
nucleotdeos, pode ser visualizada.
Porm, esta ser complementar ao
molde.
Sequenciadores
automticos
Criado em 1986 pela Applied Biosystems.
O
princpio
o
mesmo
do
sequenciamento manual feito por Sanger.
ddNTPs so marcados por fluorescncia
caracterstica, permitindo a distino das
cadeias
truncada
pela
respectiva
fluorescncia.
Sequenciadores
automticos
Feita a eletroinjeo onde as
molculas de DNA(-) em suspenso
so introduzidas nos capilares.
Cada fragmento, recebe um feixe de
laser de argnio, que ser detectado
por um sistema ptico e uma cmara
de CCD.
Sequenciadores
automticos
A ordem em que os diferentes
fragmentos passam pelo detector de
fluorescncia indica a sequncia da
cadeia de DNA complementar
cadeia usada como molde.
OBRIGADO (A) !