TRANSCRIPCIN IN VITRO

M. Valderrama

Funcin
Anlisis de bibliotecas de expresin
Estudio de seales reguladoras
mediante su fusin con genes testigo
Anlisis de productos de expresin: RNA
o protenas
Produccin de protenas y otros
compuestos peptdicos de inters para
la investigacin o su comercializacin.
Construccin de tipos celulares con
nuevas actividades.

Requerimientos
Sntesis in vitro de un mARN
Medio
Promotor
Polimerasa
Sistema
Regulacin
Se emplea el producto para
- Sonda
- Traduccin

Sistema

Uso
Sondas monocatenarias
Sin maduracin tesis de ARN
antisentido
Produccin de pre-mRNA para
estudio de maduracin o
procesamiento
Sntesis de mRNAs para su posterior
traduccin in vitro in vivo

Traduccin in vitro
Fin: Protenas
RNAm
Ribosomas
aa
Sirve
Para confirmar la identidad de genes
Estudio de seales reguladoras
Caracterizar el producto proteico
Produccin

Sistemas
E. coli
Extracto de germen
Reticulocitos de conejo
De donde viene los RNA
Procariotes
Eucariotes
Cmo se selecciona

Transcripcin in vitro
Caractersticas
Incubacin en un medio Adecuado
Promotor
RNA polimerasa

USOS
Sondas Monocatenarias
Traduccin

Sistemas usados
Proceden de virus (Bacteriofagos SP6, T7, T3)
RNA polimesa Especfica en su accin
Promotores especficos y reconocidos por la polimerasa pero no por
la polimerasa de la bacteria.
Formacin de una ADNrecombinante
Inhibidos de RNAasa

Sistemas dobles
SP6 y T7: promotor/polimerasa de los fagos
Los promotores estn en orientacin
opuesta, flanqueando al polylinker.
El DNA se clona en el polylinker y luego
este recombinante es abierto en una diana
distal al promotor viral que se va a utilizar.
La incubacin in vitro del DNA lineal con la
RNA-polimerasa produce la transcripcin.

Vectores pGEM

Sitio de inicio de la transcripcin de la T7 RNA polimerasa

1
Regin del mltiple clonacin
10 - 113
Promotor de la RNA polimerasa SP6 (17 a +3)
124 -143
Sitio de inicio de la transcripcin de la RNA polimerasa
126
pUC/M13 sitio de ligamiento del primer reverso
161-177
Codn de inicio de lacZ
165
Operador de lac
185 - .201
Regin de codificacin de la -lactamasa
1322 - 2182
Regin del fago f1
2365.2820
Secuencia del operon lac
2821- 2981, 151- 380
Sitio de ligamiento del primer forward UC/M13
2941.2957
Promotor de la T7 RNA polymerasa (17 to +3)
2984 - 3

T7 RNA polymerase transcription initiation site

1
multiple cloning region
10-128
SP6 RNA polymerase promoter (.17 to +3)
139-158
SP6 RNA polymerase transcription initiation site
141
pUC/M13 Reverse Sequencing Primer binding site
176-197
lacZ start codon
180
lac operator
200-216
-lactamase coding region
1337-2197
phage f1 region
2380-2835
lac operon sequences
2836-2996, 166-395
pUC/M13 Forward Sequencing Primer binding site
2949-2972
T7 RNA polymerase promoter (.17 to +3)
2999-3

Eficiencia de transformacin
Cuando se transforma 100l con 0.1 ng con DNA de
plsmido sin cortar la mezcla es adicionada a 900l de medio
SOC (0.1ng DNA/ml). Se hace un volumen dilucin de 1:10
con medio SOC (0.01ng DNA/ml) y 100l colocados en dos
placas (0.001ng DNA/100l). Si se obtiene 200 colonias
(promedio de dos placas), Cul es la eficiencia de
transformacin?

200cuf / 0.001 ng = 2 105cfu/ng = 2 108cfu/g DNA

Si la eficiencia es de transformacin es de 1 107cfu/g DNA podra esperarse de 10 -30 colonias
azules.
Si la eficiencia de transformacin es de 1 109cfu/g DNA podra esperarse de 100-300 colonias azules.

El sistema de vectores GEM-T y pGEM-T han sido optimizados

usando una tasa molar ng de 1:1 del DNA insertado en los vectores.
Sin embargo se han usado exitosamente tasas de 8:1 a 1:8. Si los
experimentos con productos de PCR son subptimos, puede ser
necesario optimizar las tazas. Las tasas de 3:1 a 1:3 provee un buen
parmetro inicial. La concentracin de producto PCR podra ser
estimada por comparacin de masas de DNA estndar en un gel o por
el uso de ensayos de Fluorescencia. El pGEM-T y pGEM-T tienen
aproximadamente 3kb y son suplementados a 50ng/l. Para calcular
la cantidad aproximada de producto PCR (inserto) que debe incluirse
en la reaccin de ligacin se usa la siguiente ecuacin.

ng del vector x kb tamao del inserto

x tasa molar inserto : vector
kb tamao del vector

 Los vectores pGEM usa el sistema cromognico

de deteccin de recombinantes de pUC19, ya
que contiene el gen que codifica al pptido de
lac Z que, en su regin N-terminal, incorpora al
polylinker flanqueado por los dos promotores de
fago.
Hay tipo de pGEM, Zf que son fagmidos
derivados del fago f1 (o M13) cuya induccin
produce copias circulares y monocatenarias del
recombinantes

Sistemas inducibles
Opern lac, inducible por IPTG

+ X-gal

Colonias blancas

+ X-gal

Colonias azules

Sistemas inducibles
Opern lac, inducible por IPTG
Promotor PL represor ts, inducible
por temperatura
Mixtos: Opern lac, inducible por IPTG
RNA pol T7 que reconoce Promotor T7

Ejemplo de clculo de la tasa

inserto : vector
Cuanto de producto de PCR 0.5kb es necesario
si se agrega a ligacin 50ng del vector 3.0kb si
se usa una tasa molar de inserto: vector de 3:1?
(50ng vector 0.5kb inserto)/ 3.0kb vector 3/1 =
25ng insert
Usando los mismos parmetros para una tasa
molar de inserto : vector 1:1, 8.3ng de un inserto
de 0.5kb Cunto de inserto se necesitara?

Otros sistemas
Sistema doble T7/T3
Sistema T3,T7 y SP6, colocados en
tndem
Sistemas dobles de vectores de
reemplazamiento derivados de , el cual
se usa para generar sondas empleadas
en una estrategia walking cromosmico.

Sistemas dobles de
reemplazamiento
Derivados de
Los promotores estn orientados en forma
opuesta.
Ejemplo
DASH y FIX, Tienen promotores T3 y T7
GEM Tiene promotores T7 y SP6

APLICACIONES
Produccin de sondas RNA monocatenarias
especsifica para realizar hibridacin in situ
En sistemas dobles permite obtener dos
sondas por separado.
Cuando se usa el sistema , permite
realizar sondas directamente sin clonar el
inserto en un vector plasmdico (walking)
Sntesis de RNA antisentido

Aplicaciones
Produccin de pre-RNA para estudiar su
maduracin
Sntesis de ARNm para usarla en
traduccin