Expressando uma

protena bacteriana de
ligao on mercrio em
plantas para fitoremediao de metais
pesados

INTRODUO
MATERIAIS E
MTODOS
RESULTADOS
CONCLUSES

 Mercrio, cdmio, chumbo;

Biorremediao;
Bacillus megaterium;
Arabidopsis thaliana.

Operon mer

Estirpes e plasmdeos
Bacillus megaterium MB1 contendo transposon
TnMERI1 de resistncia mercrio foi isolado
de amostras de sedimento da cidade de
Minamata Bay , Japo;
DNA total foi utilizado como molde para a
amplificao do gene merP;
Vetor pHm3 com o promotor da actina do arroz;

Construo de Bacillus MERP para a

expresso da planta
Primer sense (AramerPF):
Local de clonagem Xba I,
Sequncia de consenso da traduo de plantas
AGCCACA,
Cdon de iniciao ATG, com os primeiros 22
nucleotdeos do gene da sequncia de codificao para
MERP,

Primer antisense (AramerPR):

Stio de clonagem,
Anticdons para os ltimos 23 nucleotdeos da
sequncia de codificao MERP.

Construo de Bacillus merP

para a expresso da planta
PCR:

35 ciclos,
Desnaturao a 95 C durante 1 min,
Emparelhamento a 50 C durante 1 min,
Exteno a 72 C durante 1 min.

Fragmento amplificado, merP:

Clonagem em pGEM-T Easy vector (Promega) para confirmar a
sequncia de nucleotdeos,
Ligao ao promotor pHm3.

Figura 1. Construo do gene merP.

Transformao de Arabidopsis
thaliana e crescimento celular
Introduo de pHm3P em A. tumefaciens por
eletroporao;
Transformao de A. thaliana pelo mtodo de imerso;
Crescimento das plantas:
Esterilizao das sementes,
Germinao em meio de Murashige e Skoog contendo
mercrio, cdmio ou chumbo,
22 C,
Ciclo 16:8 h luz:escuro,

Teste de expresso do gene

Extrao e purificao do RNA total da planta
transgnica;
RT-PCR para ver a expresso de merP;
Controle positivo: purificao do RNA de B.
megaterium (MB1);

Preparao do anticorpo merP

Expresso em E. coli de merP com deleo dos
primeiros 21 aminocidos (B95P);
Purificao em coluna de troca aninica;
Soro anti-B95P a partir de coelho;
Mistura do soro com protenas de Arabidopsis para
reduzir a interferncia no especfica;

Microscopia de fluorescncia
Localizao de protenas merP:
Planta selvagem,
Planta transgnica,
3 dias aps o cultivo,

Marcador de membrana: corante vermelho;

Segundo anticorpo: Fluorescena (verde) conjugada ao
anticorpo de cabra AffiniPure anti-coelho.
Microscpio de varredura a laser confocal.

Ensaio de acumulao de metais

pesados
Espectroscopia de massa por plasma acoplado
indutivamente;
Plantas selvagens e transgnicas;
Teor de mercrio:
0,5 g de amostra
10 mL de HNO3 70%,
90 C,
180 minutos.

Ensaio de acumulao de metais

pesados
Teor de chumbo e cdmio:
0,5 g de amostra,
10 mL de HNO3 70%,
190 C,
60 minutos,
5 mL de HClO4,
190 C,
30 min.

Expresso do gene merP em

Arabdopsis thaliana transgnica
No foram observadas diferenas no crescimento
das 8 linhagens transgnicas, sendo selecionada a
linhagem BmerP-1 para as prximas a anlises;
3 gerao de BmerP-1 foi amplificada por PCR e
analisada por eletroforese;

Expresso do gene merP em

Arabdopsis thaliana transgnica
Figura 2. Confirmao da expresso do gene merP.

M1: marcador,
H2O + transcriptase reversa
(TR),
WT +: selvagem + TR,
WT - : selvagem sem TR,
BmerP +: transgnico + TR,
BmerP - : transgnico sem TR,
MB1: controle Bacillus,
M2: marcador.

Localizao de MERP na planta

transgnica
No Bacillus megaterium MB1, merP est localizado
na superfcie celular;

Figura 3. Localizao
do merP na planta
transgnica.
(microscopia confocal).
(a) Membrana.
(b) merP.
(c) Luz branca.
(d) merP na membrana.

Tolerncia a metais pesados

Figura 4. Teste controle com meio sem presena de metais pesados.

Figura 5. Ensaio de tolerncia a metais pesados.

(a) Mercrio.
(b) Cdmio.
(c) Chumbo.

Figura 6. Biossoro de metais pesados. (a) Peso fresco mdio. (b)

Adsoro total mdia por planta de metais pesados.

Acumulao de metais pesados

Mercrio (24 dias):
Planta selvagem: no germinou
Planta transgnica:
Adsoro mdia: 0,107 g/planta;
Capacidade de adsoro: 5,35 mg/g de peso
fresco;

Acumulao de metais pesados

Cdmio (12 dias):
Planta selvagem:
Adsoro mdia: 0,018 ug/planta;
Capacidade de adsoro: 5,0 ug/g peso fresco;
Planta transgnica:
Adsoro mdia: 0,019 ug/planta;
Capacidade de adsoro: 3,4 ug/g de peso
fresco.

Acumulao de metais pesados

Chumbo (12 dias):
Planta selvagem:
Adsoro mdia: 0,08 ug/planta;
Capacidade de adsoro: 20,2 ug/g peso fresco;
Planta transgnica:
Adsoro mdia: 0,09 ug/planta;
Capacidade de adsoro: 22,2 ug/g de peso
fresco.

 Capacidade de adsoro semelhante;

Crescimento celular em meio com metais
pesados na planta transgnica > planta
selvagem;
Resulta em maior absoro total;
Plantas adultas?