Estratgias biotecnolgicas na

agricultura

Prof. Dra. Adriana Cibele de Mesquita Dantas

Engenheira Agrnoma
UERGS, Bento Gonalves, RS

Biotecnologa
Biotecnologia consiste na aplicao em grande
escala, ou transferncia para indstria, dos
avanos cientficos e tecnolgicos, resultantes
de pesquisas em cincias biolgicas.
O prprio desdobramento da terminologia
implica a biotecnologia como sendo o uso de
organismos vivos (ou suas clulas e molculas)
para produo racionalizada de substncias,
gerando produtos comercializveis.

HISTRICO
Embora a palavra biotecnologia tenha sido usada
pela primeira vez em 1919 DC por um engenheiro
agrcola da Hungria, as primeiras aplicaes
biotecnolgicas pelo ser humano datam de 6.000
AC, com o uso de leveduras (organismo vivo)
para fermentar vinhos e pes (produtos).

Novas Biotecnologia
Microbiologa
Engenharia gentica
Biologa molecular
Bioqumica
Genmica
Bioinformtica
Protemica

 Biologia Celular Biologia Molecular

Limpeza clonal
Micropropagao

Marcadores moleculares

Embriogenese somtica

Mapeamento gentico de ligao

Resgate de embries

Genmica estrutural e funcional

Semente sinttica

Transformao gentica

Fuso de protoplasto

Bioinformtica

Haplodiploidizao
Variao somaclonal

Pesquisa+anlise de viabilidade tcnica = econmica

Cultura de Tecidos

Cultivo assptico in vitro de qualquer parte de

uma planta en um meio nutritivo.

Tipos de cultivos:

cultivo de clulas
cultivo de tecidos
cultivos de rgos

Cultivo de plantas ou partes de plantas

(explantes) en um meio de cultura apropriado
O cultivo se desenvolve em condies de
temperatura,
umidade,
fotoperodo
e
luminosidade controlada.

Fonte: Dr. Roberto Pedroso, Embrapa

CNPCT, Pelotas, RS

Altas taxas de multiplicao

Produo durante todo o ano
Pequeno espao para obter plantas
Obteno de material livre de doenas

Para a multiplicao massal, extremamente rpida de clones: a

programao na propagao livre de limitaes
No uso de culturas de meristema para recuperao de plantas
livres de vrus, (ou um aumentando as chances de deter uns clones
estveis e saudveis);
Fonte: Dr. Roberto Pedroso, Embrapa
CNPCT, Pelotas, RS

Certificao de mudas - microenxertia

-Obteno de plantas matrizes de alta qualidade gentica e sanitria

-Disponibilidade de matrizes
-Padronizao de plantas micropropagadas
-Testes de indexao e de pureza
-Variao somoclonal

Fonte: Dr. Roberto Pedroso, Embrapa

CNPCT, Pelotas, RS

Mtodos de melhoramento
Germoplasma
Seleo

Induo mutao

Variao somaclonal

Hibridao convencional

Transformao gentica

Hibridao somtica
(Fuso de protoplastos)

Seleo e avaliao agronmica

Variedade comercial

Germoplasma
1989 collection

Early stage after planting 1986

1993 collection

M. sieversii
in bloom

1995/96 collections
M. niedzwetzkyana
More
advanced
stage
(1200 sdgs)
form of M. sieversii

M. sieversii fruiting

Wild Malus sieversii seedling plantings

Screening M. sieversii seedlings para

Sarna scab (Venturia inaequalis)

Mecanismos referentes ao controle gentico de resistncia a Mancha

Foliar da Gala (MFG)

3.1. Inoculao em diferentes cultivares resistentes e suscetveis.

Andamento: 100%

4 ramos de crescimento do ano para cada acesso

40 cm de comprimento
6 a 8 folhas mais novas do pice caulinar

Gentipos
resistentes
do BAG de
Macieira
Epagri/E.E.Caador

3.2. Extrao DNA das cultivares e selees.

Andamento: 100%
3.3. Reao de PCR com microssatlites (SSR) com amostras de DNA.
Andamento: 100%

3.4. Anlise de diversidade gentica entre as cultivares.

Andamento: 100%
3.5. Anlise comparativa dos dados moleculares e dados morfolgicos de sintomas a
MFG.
Andamento: 100%

Anlise allica de locus resistentes e suscetveis

245 acessos do BAG

58 acessos (24%) patognicos
144 acessos (60%) - resistentes

Grupo I: Waine, PX216, PX565, Alkemene, PX322, Planaltina,

Harrold Red, D1R103T245, Rome Beauty, D1R99T15, Melrose,
Melrose, M.
aldenhamensis,
,
M.
elley,
,
Discovery,
Pome
19,
Reinete
Du
Mans,
aldenhamensis
elley
Senshu, Reinete Canada Greensleeves, D2R38T126, Hokuto, NJ49,
Condessa, NJ96, NJ41, Wilmuta, Centenria, Wealthy, D2R41T243,
Marquesa, Gala,
Gala, Pome 13, Eva, Toukou, NJR75, Yoko, Nero 26,
Bonita, Rene Reinetes, Willie Sharp.

Grupo II: concentrada a maior parte dos acessos do BAG.

Rainha e Daiane ficaram separados do restante (parentesco com
Golden Delicius)
Indicativo gentico: Daiane - germoplasma elite, isto , resultado
de cruzamentos no melhoramento da EPAGRI/Caador
Dulcina e Holy apresentaram 94% de similaridade, da mesma
forma para os acessos Nero Red Rome e Grangille Red.
Indicativo gentico: A alta similaridade gentica esperada entre
indivduos de um mesmo subgrupo, pois partilham uma origem
comum,
comum, sendo que grande parte dos acessos estudados apresentam
como parentais comuns a Golden Delicious e Delicious.
Podemos indicar que a grande maioria dos acessos analisados
apresenta divergncias genticas - fundamental em um Banco de
Germoplasma.

ANLISE DA DIVERSIDADE GENTICA EM CULTIVARES UTILIZADAS NO

PROGRAMA DEE MELHORAMENTO GENTICO DA REGIO SUL DO BRASI
POR MEIO DE MICROSSATLITES
Cultivares
Progenitores
1. Princesa
NJ56 X Anna
2. Fred Hough
NJ76 X Coop 14
3. Duquesa
Anna x D1R100T147
4. Melrose
Jonathan x Delicious
5. Idared
Wagenerapfel x Jonathan
6. Coop 14
PRI 10-147 x Mollies Delicious
7. NJ 56
(Golden x ????)
8. Royal Gala
Mutao Gala
9. Imperial Gala
Mutao Gala
10. Galaxy
Mutao Gala
11. Gala
Kidds Orange x Golden Delicious
12. Braeburn
Lady Hamilton x Granny Smith
13. Catarina
Fuji x PWR37T133
14. Baronesa
Princesa x Fuji
15.Condessa
Gala x M-41(Princesa)
16. Daiane
Gala x Princesa
17. Imperatriz
Gala x MollieDelicious
18. Joaquina
NJ76 x Coop14
19. Eva
Gal x Anna
20. Fuji
Ralls Janet x Delicious
21. Mutsu
Golden Delicious x Indo
22.Granny Smith
Seedling de French Crab
23. Anna
Golden Delicious x Red Hadassiya
24. Gloster
Pomme Cloehe x Richared Delicious
25. Alkmene
Cox Orange Pippin x Dr Oldeenberg
26. Delicious
Desconhecido

Origem
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
New Zealand
New Zealand
New Zealand
New Zealand
New Zealand
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Japo
Japo
Austrlia
Israel
Alemanha
Blgica
-

Fred-Hough
Fred-Hough
Anna
Anna
Duquesa
Duquesa
Baronesa
Baronesa
Coop-14
Coop-14
Eva
Eva
Fuji
Fuji
Royal-Gala
Royal-Gala
Idared
Idared
Delicious
Delicious
Alkeme
Alkeme
Galaxy
Galaxy
Gala
Gala
Imperial-Gala
Imperial-Gala
Condessa
Condessa
Melrose
Melrose
Imperatriz
Imperatriz
Princesa
Princesa
Joaquina
Joaquina
Daiane
Daiane
NJ56
NJ56
Catarina
Catarina
Mutsu
Mutsu
Granny-Smith
Granny-Smith
Braeburn
Braeburn
Gloster
Gloster
0.10
0.10

0.15
0.15

0.20
0.20

0.25
0.30
0.35
0.40
0.25
0.30
0.35
0.40
Coeficienete
Coeficienete de
de Similaridade
Similaridade Gentica
Gentica

0.45
0.45

0.50
0.50

0.55
0.55

II

III

IV

V
VI
VII

Caracterizao de populaes e cultivares do Programa de

Melhoramento gentico da Macieira

Objetivo
Caracterizar fenotipicamente populaes e selees pr-estabelecidas de
macieira e que estejam segregando para caractersticas de importncia
comercial.
1. M-13/91 x M-46/94 (mancha foliar da Gala e baixa exigncia em frio)
2. Joaquina x Imperatriz (mancha foliar da Gala e russeting)
3. Catarina x Fred Hough (mancha foliar da Gala, ao odio e bitter
pit)
4. Imperatriz x Primcia (russeting e ramos com ngulo a 90C)
5. MRC-11/95 x Fred Hough (alta e baixa acidez e baixa exigncia em
frio)

Determinao da compatibilidade gametoftica em cultivares resistentes a

MFG.
Caracterizao histomorfolgica da biologia reprodutiva de cultivares de
macieira

CARACTERIZAO MOLECULAR E FISIOLGICA DA

INCOMPATIBILIDADE ALLICA ENTRE CULTIVARES DE MACIEIRA

(LFDGV-CCA UFSC) e (EECD-EPAGRI).

Auto-incompatibilidade
Gametoftica

Compatibilidade Gametoftica

Superfcie estigmtica

(Albuquerque Junior, et al., 2005)

L 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 1 9 9 10 10 11 11 12 12 L
S24

S1

S3
S5 S19

S3

S19

S2
S9
S5

S1
S9

S2

S3

S5

S2 S3

S5

S19

Figura 1. Separao de produtos amplificados (alelos S) em

macieira
Tabela 1. Alelos-S de incompatibilidade gametoftica em 12 cultivares

Cultivar

Alelo-S

Cultivar

Alelo-S

Cultivar

Alelo-S

1- Primcia

S24 ?

5- Baronesa

S3 S9

9- Daiane

S3 S5

2- Princesa

S3 S5

6- Lisgala

S2 S5

10- Duquesa

S2 S3

3- F. Hough

S5 S19

7- F. Suprema S1 S9

11- Imperatriz

S3 S5

4- Catarina

S1 S19

8- Condessa

12- Joaquina

S5 S19

S2 ?

Hibridao somtica

calo

diviso

Protoplato calos

Protoplasto folha

microcolnia

microcalos

Planta in vitro

Planta aclimatizada

Fonte: Dr. Francisco A. Mouro Filho

ESALQ USP, Piracicaba, SP

Fuso

Embriognese

Resultados e discusso

Regenerao: organognese

Anteras
Hfer et al. (1999): macro N6 + micro MS (CuSO4.5H2O e Na2MoO4.2H2O) +
vitaminas B5 + glutamina + MES + 90g.L-1 de maltose

20m
5mm

Micrsporos
uninucleados

Purificao de protoplastos

20m

Viabilidade e rendimento

30 m

Cultivo de protoplastos
Aos 7 e 14 dias: estgios inicias de
divises celulares
Aos 21 dias: formao de agregados
celulares (microcolnias)
Aos 28 dias: presena de microcalos
como conseqncia de sucessivas
divises celulares das microcolnias
Aos 35 dias: observar a olho nu os
microcalos que formaram grnulos
minsculos

Hbridos somticos confirmados

Laranja Caipira + limo Cravo

Laranja Caipira + tangerina Clepatra
Laranja Caipira + limo Volkameriano
Tangerina Cleopatra + limo Volkameriano
Limo Cravo + tangerina Sunki
Laranja Ruby Blood + limo Volkameriano
Tangerina Clepatra + laranja azeda
Limo Cravo + laranja azeda
Laranja Caipira + limo Rugoso
Laranja Valncia Rohde Red + limo Volkameriano
Laranja Valncia + Fortunella sp
Laranja Hamlin + toranja Singapura
Laranja Hamlin + toranja Indian Red
Laranja Hamlin + tangerina Montenegrina

Fonte: Dr. Francisco A. Mouro Filho

ESALQ USP, Piracicaba, SP

Hbridos somticos
Avaliao no campo

Enxertia e detalhe do
sistema radicular
Fonte: Dr. Francisco A. Mouro Filho
ESALQ USP, Piracicaba, SP

Plantio na EECB

Avaliao de hbridos somticos para Phytophthora.

Fonte: Dr. Francisco A. Mouro Filho

ESALQ USP, Piracicaba, SP

Morte Sbita dos Citros

VALNCIA/CLEPATRA
Fonte: Dr. Francisco A. Mouro Filho
ESALQ USP, Piracicaba, SP

VALNCIA/CRAVO

Subenxertia de hbridos somticos em duas

reas afetadas por MSC

Colmbia
Fonte: Dr. Francisco A. Mouro Filho
ESALQ USP, Piracicaba, SP

Comendador Gomes

INTERAO
PATGENO X HOSPEDEIRO
Plantas superiores
tem desenvolvido
complexos
mecanismos de
percepo e
transduo do
sinal do ataque do
patgeno

CARACTERIZAO MORFOLGICA, PATOGNICA E MOLECULAR

DE ISOLADOS DE Colletotrichum spp. EM MACIERA

Tabela 1. Origem dos isolados (pomar e localidade) coletados nos Estados do Paran, Santa

respectivos locais de origem.

Catarina e Rio Grande do Sul.

Origem/Local ou produtor
1.Fazenda Palma
2. Orival S
3. Joo Costa
4. Srgio Melhorim
5. Paulo Okamoto
6. Cooperserra
7. Fumio Hiragami
8. Fumio Hiragami
9. Vilmar Zanette
10. Jair Philipi
11. Masui Takizawa
12. Agrcola Fraiburgo
13. Agrcola Fraiburgo
14. Fischer
15. Pomifrai
16. Fischer
17. Fischer
18. Fischer
19. E. E. Caador/ Epagri
20. Rio das Antas
21. Norihisa Abe
22. Francisco Hamada
23. Agrcola Fraiburgo
24. Schio
25. Pomifrai 125 Fraiburgo
26. Fischer Fraiburgo
27. E.E. So Joaquim/ Epagri
28. Perboni
29. Agrcola MH
TOTAL

Procedncia/Pomar
So Joaquim/Fazenda dos Palma
So Joaquim Santa Isabel
So Joaquim Santa Isabel
So Joaquim Santa Isabel
So Joaquim
So Joaquim
So Joaquim Boava
Painel
Bom Jardim da Serra/Despraiado
Bom Retiro
Frei Rogrio
gua Doce
Fraiburgo
Fraiburgo
Fraiburgo
Fraiburgo/ Fertilidade
Fraiburgo/ Moinho Azul
Fraiburgo/ Rio Mansinho
Caador
Rio das Antas
Palmas, PR
Palmas, PR
Vacaria, RS
Vacaria, RS
Fraiburgo, SC
Fraiburgo, SC
So Joaquim, SC
Palmeira, PR
Campo Tenente, PR

Tabela 2. Isolados de Colletotrichum selecionados para a realizao do trabalho e seus

N de isolados
7
6
7
3
6
9
3
4
9
6
11
3
4
14
10
3
8
6
6
7
10
12
10
7
5
4
5
18
14
207

Isolados
1*
2*
3
4#
5#
6
7
8
9
10+
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40

Procedncia
Caador/ SC
Caador/ SC
Caador/ SC
Vacaria/ RS
Vacaria/ RS
Frei Rogrio/ SC
Frei Rogrio/ SC
Frei Rogrio/ SC
Frei Rogrio/ SC
Curitibanos/ SC
So Joaquim/ SC
So Joaquim/ SC
So Joaquim/ SC
Palmas/ PR
Fraiburgo/ SC
Fraiburgo/ SC
Campo Tenente/ PR
Campo Tenente/ PR
Campo Tenente/ PR
Campo Tenente/ PR
Campo Tenente/ PR
Palmeira/ PR
Palmeira/ PR
Palmeira/ PR
Palmeira/ PR
Palmeira/ PR
Palmeira/ PR
Palmeira/ PR
Palmeira/ PR
Palmeira/ PR
Fraiburgo
Fraiburgo
Fraiburgo
Fraiburgo
Palmas/ PR
Palmas/ PR
Palmas/ PR
So Joaquim/ SC
So Joaquim/ SC
So Joaquim/ SC

Caractersticas
morfolgicas

Figura 1. Colnia de Colletotrichum spp. apresentando formao de setores em meio de cultura BDA. A vista frontal da placa de
petri; B- vista do verso da placa de petri.

Figura 2. Condios de Colletotrichum spp. observados em aumento de 40 X, atravs de contraste de fase. A - isolado
1 (proveniente de Caador, SC); B - isolado 10 (proveniente de Curitibanos, SC); C isolado 38 (proveniente de So
Joaquim, SC).

 Caractersticas culturais e morfolgica dos condios

3 tipos de colnias (colorao)

Colnias de Colletotrichum representativas de cada um dos trs grupos

formados no presente estudo. A) Grupo I; B) Grupo II; C) Grupo III.

Avaliao da sensibilidade dos isolados ao fungicida

benomyl

Isolados resistentes:
17, 18, 19, 20 e 21 - Campo Tenente/ PR
1, 2 e 3 - Caador, SC
31, 32, 33 e 34 - Fraiburgo, SC
35, 36 e 37 - Palmas, PR
38, 39 e 40 - So Joaquim, SC.

Isolados sensveis:
4 e 5 - Vacaria, RS
6, 7, 8 e 9 - Frei Rogrio, SC
10 - Curitibanos, SC
11, 12 e 13 - So Joaquim, SC
14 de Palmas, PR
15 e 16 - Fraiburgo, SC
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 e 30 - Palmeira, PR

Figura 2. Isolados de Colletotrichum spp. submetidos a meio de cultura BDA suplementado com fungicida
benomyl (100 g.mL-1).
A Isolado sensvel (10, Curitibanos, SC);
B- isolado resistente (20, Campo Tenente, PR).

Tabela 9. Caractersticas culturais de isolados de Colletotrichum spp. isolados de macieira,

oriundos de diversas regies produtoras do Brasil.
Grupo Isolados

Caractersticas

1, 2

Sem presena de peritcios e formao de setores. Crescimento cilndrico. Caador, SC;

31, 32, 33 e 34

Colnias de colorao rosada em ambos os lados da placa de petri.

II

III

Procedncias
Fraiburgo, SC

35, 36, 37

Palmas, PR

38, 39, 40

So Joaquim, SC

Formao de peritcios em meio de cultura; eventual formao de setores; Caador, SC

4, 5

crescimento cilndrico. Colnias de colorao branco-oliva em ambos os Vacaria, SC

6, 9

lados da placa de petri.

Frei Rogrio, SC

10

Curitibanos, SC

11, 12, 13

So Joaquim, SC

14

Palmas, PR

15, 16

Fraiburgo, SC

17, 18, 19, 20, 21

Campo Tenente, PR

22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30

Palmeira, PR

7e8

Formao de peritcios em meio de cultura; formao de setores; Frei Rogrio, SC

crescimento cilndrico. Colnias de colorao branco-marrom na parte de
baixo da placa de petri e branco- acinzentada na parte de cima da placa

Figure 1. MFG symptoms caused by

Colletotrichum gloeosporioides isolate 197SJ
on apple leaves. A) colonies with mycelia
growth and induce sporulation were subcultured by transfer to fresh medium even after
seven days grown on potato dextrose agar
(PDA) treated with streptomycin (300 ppm),
B) The plants in growth chamber that
maintained continuous plant surface wetness
for 7 days at 25C with a 16 h photoperiod
(200 mol s1 m2), C) Gala at 36 hpi with
spots reddish, D) Fuji (resistant) inoculated no
disease symptoms and Gala with symptoms,
both at 48 hpi, E) Gala at 72 hpi with
spreading of the spot into the limbo of
terminal leaves; F) Gala at 96 hpi, lesion
evolves to reddish brown margins develop
dark spots and then dried leaves.

E O PATGENO ?
Avaliao da estrutura gentica e patogenicidade em
diferentes isolados de diferentes regies por marcadores
moleculares

isolado SJ 197

Avaliao: 72 e 96 horas

1 x 106 condios/ ml

cmara mida: 24 1C; U.R 100 %

 2 tipos de
sintomas

MG

Leses
necrticas
Incidncia variando de
0 a 100%
Severidade variando
entre 0,15 a 7,0.

 2 tipos de
sintomas

MG

PA
Isolados oriundos de leses
de MG

Isolados oriundos de leses de

PA e leses necrticas

Elucidao dos aspectos morfo-histolgico desta int

MEV
MET

Pesquisas
1. Comportamento de variedades frente a doena;
2. Aspectos cito-histopatolgicos;
3. Sensibilidade a fungicidas
4. Estudos histopatolgicos, citoquimicos e ultraestruturais do processo de infeco.
Objetivo
Estudar, atravs da microscopia ptica e eletrnica a multiplicao do patgeno no
interior das clulas e a extenso dos danos nos tecidos vegetais.

A) Gala 24 horas, bar. 33,3

m; B) Fuji 24 horas, bar. 33,3
m;
C) Gala 48 horas, bar. 16,7
m; D) Fuji 48 horas, bar. 16, 7
m;
E) Gala 96 horas, bar. 6,7 m;
F) Gala 120 horas, bar. 66,7
m (fv) feixe vascular;
(pl) parnquima lacunoso;
(pp) parnquima paliadico;
(esp) esporo germinativo;
(ep) epiderme;
(fl) floema;
(xil) xilema;
(mic) miclio;
(cut) cutcula;

Figure 3. upperview of fresh leaf

apple = A) Fuji at 24 h
postinoculation (hpi); B), Fuji at 48 h
pi C) Fuji at 72 h pi; D) Fuji at 72 h
pi, two appressoria were formed a
very short germ tube adjacent; E) Fuji
at 96 h pi F) Gala at 24 hpi G) Gala at
48 h pi; H) Gala 96 h pi, appressoria
were formed of a long germ tube;
I)Gala at 96 h pi; J) Gala at 72 h pi);;
K Gala at 72 h pi) L) Fuji at 48 h pi;;
M) Fuji at 48 h pi, appresoria
hialinos; N) Fuji at 48 h pi; O) Gala
at 72 h pi, P) Gala at 72 hpi. bright
field microscopy and fluorescencia
380 nm

Figura 1. Evoluo
da doena observada
em diferentes tempos
na cv. Gala.

Gala 48 horas

Clula palidica

Fuji 48 horas

Figura 2. Reao
histolgica em cv.
Fuji e Gala com 48
aps inoculao..

Fuji 12 - 228 5000x 10kv 11mm

Fuji 36 - 232 2000x 10kv 30nm

Fuji 24 - 228B 3000x 10kv 11mm

Fuji 72 - 15kv 1250x 11mm

Capacidade de detectar polimorfismo entre os isolados das diferentes regies

OPA19
pb

M1 2

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M

2072 1500 600 -

Caador Vacaria

Frei Rogrio

So J oaquim

Campo tenente

Palmeira

Fraiburgo

Palmas So J oaquim

Capacidade de distinguir geneticamente isolados com caractersticas morfolgicas

particulares (ex.: resistncia ao benomyl)
OPA07
pb
2072 1500 600 -

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M

Variabilidade por marcador

RAPD
pb

M 1 2

3 4

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M

2072 1500 600 Caador Vacaria

Frei Rogrio

So J oaquim

Campo tenente

Palmeira

Fraiburgo

Palmas So J oaquim

Figura 1. Polimorfismo gerado pelo iniciador OPA 19 em 39 isolados de Colletotrichum spp. em gel
de agarose 1,5% corado com brometo de etideo (0,5 g/ml).

pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M

2072 1500 600 -

Figura 3. Polimorfismo gerado pelo iniciador OPA 07 em 39 isolados de Colletotrichum spp. A flecha mostra
os isolados 17, 18, 19, 20 e 21 resistentes ao benomyl com bandas monomorficas.

Cd-1
Cd-2
FI-31
FI-32
FI-33
FI-34
PAP-35
PAP-37
PAP-36
HET10
HET11
HET12
Cd-3
PB-26
PB-27
Ctb-10
PB-22
PB-30
FR-6
PB-25
PB-28
Plm-14
Fb-15
Fb-16
PB-24
SJ-11
SJ-12
SJ-13
FR-9
MH-17
MH-19
MH-20
MH-21
MH-18
PB-29
Vc-4
Vc-5
HET1
HET2
HET3
HET4
HET6
HET7
HET8
HET9
HET13
HET14
HET15
HET5
FR-7
FR-8
PASJ-38
PASJ-39
PASJ-40

0.15

0.29

0.43

0.57

0.72

Coefficient
Coeficiente de
similaridade

0.86

1.00

Caador (Becker)
Fraiburgo (Atipico)
Podr. Amarga Palmas
Heterocariontes
Caador Estao
Per Boni PR
Curitibanos
Per Boni PR
Frei Rogrio
Per Boni PR
Palmas
Fraiburgo
Per Boni PR
So Joaquim
Frei Rogrio
PR
PR
Vacaria

Hetero

Frei Rogrio
Podr Amarga So Joaquim

Obteno de um dendograma e rvore filogentica da estrutura

gentica do DNA ribossomal de Colletotrichum

2.3. Extrao do DNA dos isolados.

2.4. Cortes do DNA com enzimas de restrio.

Perfis obtidos com as enzimas de restries da
regio ITS do rDNA dos isolados de
Colletotrichum spp.
M Marcador Ladder 100 pb;
P fragmento padro sem clivagem com
enzima de restrio.
Outras canaletas - rDNA dos isolados digeridos
com as endonucleases de restrio
Rsa I, Alu I, Hinf I, Hpa II, Hha I, Acc I, Eco RI e
Taq I

2.5. Reao de PCR com marcadores ITS (internal transcript space).

Os produtos de PCR obtidos na amplificao da regio ITS1-5.8S-ITS2 do DNA
ribossomal de todos os isolados de Colletotrichum spp apresentaram em torno de 600
pares de base (pb)

Figura 1.Produto do PCR resultante da utilizao dos iniciadores ITS1 e ITS4, em

gel de agarose 2% mostrando o fragmento obtido de 600 pb em todos os isolados
de Colletotrichum spp, obtidos de macieira, goiaba e citros (M ladder 100 pb e
CN controle negativo).

 2.6. Anlise de diversidade entre os isolados de

MFG em Macieira.

Genes e Proteinas
transcrio

mRNA
Gene
(um pedao de DNA)

proteina

translao

fentipo

MARCADORES MARCAS
GENES?

MARCADORES
Morfolgicos

Bioqumicos

DNA

RNA

Marcadores moleculares

Ferramentas da Biologia
Molecular

Enzima de restrio

PCR
Termociclador
Eletroforese

DNA ligase

Extrao de DNA/RNA
Sol. extratora

Adio de CIA
1.5
1.5

1.0

0.5

Centrifugao

1.0

0.5

Amostra

0.1

Adio de etanol

RNAse

1.5

1.0
0.5
0.1

pellet

Revelando gel de agarose em U.V. brometo de

etdeo

Tcnicas representativas para anlise de cidos nucleicos

1) Hybridization-based techniques:
Multi-locus minisatellite fingerprinting (Jeffreys et al., 1985)
Oligonucleotide fingerprinting (Ali et al. 1986; Weising et al. 1991)
Restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Wyman and White 1980, Botstein et al.1980)

(2) Amplification-based nucleic acid scanning techniques:

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) (Williams et al. 1990)
Arbitrarily primed PCR (AP-PCR) (Welsh and McClelland 1990)
DNA amplification fingerprinting (DAF) (Caetano-Anolls et al. 1991)
Minihairpin primer-driven DAF (mhpDAF) Caetano-Anolls and Gresshoff 1994)
Arbitrary signatures from amplification profiles (ASAP) (Caetano-Anolls and Gresshoff 1996)
AFLP (Vos et al. 1995)

Alu-PCR (Nelson et al. 1989)

Microsatellite-primed PCR (MP-PCR) (Meyer et al. 1993; Perring et al. 1993)

Anchored MP-PCR (AMP-PCR) (Zietkiewicz et al. 1994)
Random amplified microsatellite polymorphism (RAMP) (Wu et al. 1994)
Nucleic acid scanning-by-hybridization (NASBH) (Salazar and Caetano-Anolls 1996)
RAPD dot-blot hybridization (Penner et al. 1996)
Differential display reverse transcription (DDRT) PCR (Liang and Pardee 1992)
RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) (Welsh et al. 1992)
cDNA-AFLP (Bachem et al. 1996)

(3) Amplification-based nucleic acid profiling techniques:

Amplified fragment length polymorphism (AmpFLP) (Jeffreys et al. 1988)
Minisatellite variant repeat PCR (MVR-PCR) (Jeffreys et al. 1991)
Simple sequence repeat PCR (SSR-PCR) (Litt and Luty 1989, Weber and May 1989, Tautz 1989)

(4) Sequence-targeted techniques:

Allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization (Saiki et al. 1986)
TaqMan ASO (Livak et al. 1995)
Allele specific reverse dot blot hybridization (Keller et al. 1991)
Single strand conformation polymorphism (SSCP) (Orita et al. 1989)
Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) analysis (Konieczny and Ausubel 1993)
Coupled amplification and sequencing (CAS) (Ruano and Kidd 1991)
Amplification refractory mutation system (ARMS) (Newton et al. 1989)
Oligonucleotide ligation assay (OLA) (Landegren et al. 1988, Nickerson et al. 1990)
Coupled amplification and oligonucleotide ligation (CAL) (Eggerding 1995)

Organizao do genoma
nuclear

C
T
G
G
A
C
T
CCTGATGGATCGCGTACGTTGTACGCACAGTGTCGAAAAAG
CATACGGGGACTGCACGTACACGTAGCACGGCGTCGATTTT
GACGTGCACGTGTCAGTGCGATGAGTGAGTGACACACAGTG
CAGCGTGTGTACCCATGCGCGAAGTATGT

COMO ISOLAR
ISOLAR UM
UM GENE
GENE DE
DE
COMO
RESISTNCIA?
RESISTNCIA?

Genoma estrutural
Mapeamento de
gene

Sequenciamento

Anotao
gnica

Genoma funcional
Perfil de
expresso

Transcriptoma

Protemica

Anotao
gnica

A BUSCA...

DE QUAL FORMA ?

Marcador molecular
Polimorfismo
Anlise de segregao
Mapa gentico
Mapeamento de
interesse (QRL QTL)

Sequenciamento de DNA

Bancos de sequencias
Biblioteca genmica
Genoma funcional

Expresso gnica - RNAm

Marcadores moleculares

Mapeamento gentico de
ligao

840
marcadores
:
475 AFLPs
235 RAPDs
129 SSRs

Identificar marcadores genticos

ligados aos genes de interesse, nos
respectivos cromossomos.

Xu e Korban (2000)

Genes R - RGAs

(resistance gene

homologues)

C-terminal

N-terminal
P-loop

RNBS-A
No TIR

RNBS-A
TIR

Kinase-2
W/D

Seqncias
conservada
se
universais

3F2
2F
OLE 1121
Primers antisense
P1b
P3d
RNBS-D
1R1
P3b
13R1
11R1
OLE 122

RNBS-D
No TIR

RNBS-D
TIR

200 aa mono + dicotiledneas

200 aa dicotiledneas

Primers Sense
39F1
P1a
P3a
LM638
1F
P1c

GLPL

Motivos
P-loop (n-terminal):
P-Loop
GLPL
P-loop
P-loop-GKTT
P-loop-GKTT non TIR
Arabidopsis
kinase
nbs-2
P-loop
Motivos
P-loop
GLPL
P-loop
GLPL non TIR Arabidopsis
GLPL C-terminal
GLPl C-terminal
GLPLAL

Sequencia 5- 3
TCATCAAGGACGAGCTGARWBNATGMA
GGIATGCCIGGIIIIGGIAARACIAC
AIITYIRIIR YIAGIGGYAA ICC
GGI GGI GTI GGI AAI ACI AC
GGCGGGGTGGGCAARACNACNHT
GGICGICCIGGIIIIGGIAARACIAC
GAGGTACTTCCTGGTGCTGGAYGAYRTBTG
AACGGCTGCAGGATCATGRTBACHACHMG
GGWATGGEGGWRTHGGWAARACHAC
Sequencia 5- 3
GGIATGGGIGGIIIIGGIAARACIAC
AIITYIRIIR YYAAIGGIAG ICC
GGR AAI ARI SHR CAR TAI VIR AAR C
CGTGCTGGGCCAGGGTNGTYTTNCC
AIITYIRIIRYIAGIGGIAGICC
CGGCCAAGTCGTGCAYVAKRTCRTGCA
TCAGCTTGCCGATCCACTYDGGSAGBYT
ARNWYYTTVARDGCVARWGGVARWCC

RGAs polimrficos

39F1/1R1
MF G Br Bs A

2F/13R1
G Br Bs A

C-terminal

N-terminal
P-loop

RNBS-A
No TIR

RNBS-A
TIR

Motivos exclusivos TIR

Kinase-2
W/D

RNBS-D
No TIR

GLPL

RNBS-D
TIR

FIGURA 2. Representao do domnio NBS indicando os

motivos caractersticos das subclasses TIR e no TIR.

Motivos exclusivos no TIR

Motivos TIR e no TIR

39F1/1R1
G Br
Bs

1F/P3b
G
Br Bs

3F2/13R1
G
Br Bs

2F/13R1
G
Br
Bs

1000

500
400

100

FIGURA 8. Regies amplificadas dos primers degenerados (39F1/1R1; 1F/P3b; 3F2/13R1; 2F/13R1). F: cultivar Fuji, G:
cultivar Gala, Br: Bulk de resistncia e Bs: Bulk de suscetveis.

39

LRR

NB-ARC

N-Term
1

13

11

ANALOGIA DE ALGUNS GENES DE RESISTNCIA OBTIDOS DA CV. FUJI

Clones
nn s

Acess on no. of
matching

Motifs primers

Source of
matching
sequence

Matching sequence from

database

Best e-value
(BLASTX)

A09-E09E08A10E10

73658570|
CAJ27146.1

NBS-2
GLPL Cterminal

Rosa hybrid
cultivar

putative LZ-NBS-LRR
resistance protein

3.81e-37

E12-A12

50406840|
CO576596.
1

NBS-2 GLPL-Cteriminal

Malus x
domestica

HYPOTHETICAL PROTEIN
mRNA sequence

6.34e-117

C09-G09

AY599223.1

P-loop-GKTT
GLPL non TIR

Prunus persica

NBS/LRR disease resistance

protein RPMI

2,79e-27

C10-G10

47059739|
AAT09451.1
|

P-loop-GKTT
GLPL non TIR

Prunus persica

A05-E05

21745024|
AF516631.1

Kinase
GLPL-C-terminal

Malus prunifolia

A01-E01

AAT09451.1

Kinase
GLPL-C-terminal

Prunus persica

NBS-LRR disease resistance

preotein

1.89e-71

A03 E03

92883347|
ABE86887.1

Kinase
GLPL-C-terminal

Medicago
truncatula

Disease resistance protein;

Peptidase aspartic,
active site AAA ATPase

4.05e-65

putative NBS-LRR type

disease resistance
protein
putative disease resistance
gene analog like NBS
LRR (RGAI8)

3.70e-67

8.36e-25

 Resduo altamente conservado no motivo

do domnio NBS conhecido como quinase
2 (LLVLDDW/D);
Pode ser usado para indicar a presena do
domnio TIR com 95% de certeza;
O triptofano (W) encontrado em
protenas que contm o domnio TIR;
Estes diferentes motivos que caracterizam
as subfamlias do domnio NBS-LRR;
Facilitam a busca diferenciada de RGAs
caracterstico de cada subfamlia.
Figure 4. Alignment of protein sequences of
contigs identified as RGAs X via BLAST
with sequences of RGAs of the family
Rosaceae: 1: Malus baccata; 2: Malus
prunifolia; 3: Malus x domestica; 4: Fragaria
chiloensis; 5: Fragaria vesca; 6: Fragaria x
ananassa. The region where FNRMAF
kinase 2 (left side).

Tcnicas de DNA recombinante

Fundamentos:
-Descoberta da enzima de restrio
-Descoberta da DNA ligase
-Vetores de clonagem
-Desenvolvimento de mtodos de
transformao
-Desenvolvimento de mtodos de
seleo

PREPARAO DO DNA (CLONAGEM)

Plasmdeo

Clivagem com
nuclease de
restrio

Multiplicao
via colnias
bacterianas

Insero de
fragmento
de DNA

Prospeco de genes associados a mecanismos de resistncia

a mancha foliar (Colletotrichum gloeosporioides) em macieira

Micro arranjos
Microarranjos
Expressed Sequence Tags
Genes diferencialmente expressos
exclusivos de uma forma

Biblioteca resistente

Biblioteca suscetvel

Genes comuns

Analise dos genes candidatos Microarray

Collaborative Partnership
(US-Brasil) on Apple Functional
Genomics

Microarranjos

Expression analysis of resistance to C. gloeosporioides on apple by microarrays

Adriana Cibele de Mesquita Dantas, Danman Zheng, Schuyler Korban, Salatiel Wohlmuth,
Jos Itamar Boneti

Fuji 24 horas aps inoculao

Construo de mapas genticos e mapeamento de QTLs

por marcadores moleculares

Objetivos
Construo de mapas genticos e anlise de ligao de caractersticas de
interesse

Genotipagem em Sequenciador: HRI Wellesbourne, UK

Horticulture and Food Research Institute of New Zealand,
Ackland (Guilford et al., 1997)

- 300 Marcadores microssatlites

- ESTs sequenciados

Institute of Plant Sciences, Swiss Fedeeral Institute of

Technology, Zurich, Switzerland

- Saturao de mapas com AFLP

(Gianfranceschi et al. 1998; Libehard et al., 2002)

Cornell University, Geneva, NY, USA

(Hemmat et al. 2003)

Avaliao das populaes de

mapeamento

Sintomas de Mancha Foliar da Gala 72h aps a inoculao:

A)

Contraste entre planta resistente e suscetvel na populao proveniente do

cruzamento M13/91 x Gala.

A)

Contraste entre duas plantas suscetveis e uma resistente (centro)

provenientes do cruzamento M13/91 x M46/94.

Tolerncia ao alumnio e absoro de clcio

Nvel de tolerncia e suscetibilidade dos parentais ao
alumnio
Plantadas em areia lavada + soluo
nutritiva

estacas dos portaenxertos parentais

Imerso em AIB
(2mg.L-1)

Aps 20
dias

Soluo nutritiva de Edwards et al (1976) + tratamentos

= Al3+ (0,0; 50 ; 150 ; 250 e 350 M), durante 20 dias.

Otimizao de marcadores AFLP e

SSR

MF2

MF1

MF3

0,0

6b50

0,0

25,7
41,7

1f350
1b20

29,5

7f100

61,5

1b80

56,2

5h650

82,9

5h400

109,6

5h80

87,2
116,6
146,3

5e350
8a280

5g400

205,5

2g25

247,8

1f300
6b140

267,4

5h100

298,1

5e500

324,9

1b25

353,4

2d310

385,9

2d420

416,7

7f200

450,4
468,8

5e640
5e630

MF5

6g450

0,0

8e170r

0,0

5h220r

31

s11r

33,6

63,1

5g210

57,2

1e480
1e400

91,7

5g80

89,4

8a80

116,8

6b280

140,9

6b250

131

5g150

156,2
171

8h130
8h110

190,7

8d550

208,3

8c480

235,1

122,9

8c470

154,3

5g190

1b280

176

228

MF4
0,0

MF6
6g180r

MF8

0,0

7a680

7d650

21,5

7a630

267,1

8c520

50,6

7a200

300,9

8c640

78,0

7a700

0,0

1f50r

27,9

7f250

52,4

7f410r

57,7

7f230

70,6

7f180r

91,8

6b120r

83,6

1b70

MF10
0,0

8c280

0,0

5d180

29,5

2d120

28,3

5d350

30,9

6b90

6d50

MF14

MF13

0,0

8e250

8a150

MF12

MF11

0,0
6d100

8a110
31,2

34,3

6g380

29,8

MF9
MF7

0,0

0,0
22,4

S9

Cogl

0,0

20,9

2g50

2g120

Mapa gentico de ligao da cv. Melrose. A direita, os 69 marcadores AFLP e dois SSRs (S9 e S11) ligados
em cada um dos 14 grupos estabelecidos com LOD 3.0 e distncia mxima de 35 cm (funo Kosambi). A
esquerda, distncia (cM) acumulada entre os marcadores. r = fase repulso. Cogl = loco de Colletotrichum
gloeosporioides

G0

Gp

F0

1 kb Fuji 0 Gala
0

Fp

DNA
RNA 28S
RNA 18S

12
1.6

mRNA

RNA 5.8S

1.0

mRNA

0.5

RNA mensageiro
(nuvens)

Gel de agarose 1,5% com 1 L brometo de etdeo (10 mg/mL)

G0 - Gala sem inculo; Gp - Gala com inculo (pool de perodos);
F0 - Fuji sem inculo; Fp - Fuji com inculo (pool de perodos)

Construes de bibliotecas subtrativas 500 clones

cada

Equipe: Adriana Cibele de Mesquita Dantas; Yoshinori Katsurayama, Antonio lvaro

Purcino Corsetti, Ubiraci Gomes de Paula Lana, Eliane Aparecida Gomes, Newton
Carneiro, Claudia Teixeira Guimares
Bibliotecas
Tester
Driver
Genes
SSH-A

Fuji com inc (pool)

Fuji sem inoc (zero)

Induzidos

SSH-B

Fuji com inc (pool)

Gala com inc (pool)

Constitutivos/expressos

SSH-C

Fuji sem inc (zero)

Gala sem inc (zero)

Constitutivos

Construo de Biblioteca cDNA Full-length

[SuperScript

Plasmid System with Gateway

Technology for cDNA Systhesis and Cloning]

Fuji inoculada pool 3.000 clones

1 Kb
PCR1
PCR 2

PCR 2 PCR1 PCR 2

Bibl. A

Bibl. B

PCR1

Bibl. C

1600
1000

500

Gel agarose 1,5% - gel fino: 20

mL

Sequenciamento dos transcriptoma

suppression subtractive hybridization
Localizar os transcritos iniciais de resposta ao ataque
1. Em que tecido e em que tempo?
2. Caracterizao funcional de genes
diferencialmente expressos a partir da infeco de
cultivares infectadas
3. Obteno do RNAm
4. Construo de Bibliotecas subtrativas cDNA
Isolamento do gene expresso
pela subtrao ao no expresso

ESTs (Expression Sequences

Tags)

cDNA
AAAAAAAAA

Extrao RNAm + Oligo (dT)

RT

TTTTTTTTT

PCR
Clonagem

Seqenciamento

 Gilbert e Sanger:
70s: 20 bases em dois anos

Seqenciamento automtico
Capilar

Seqenciamento manual
Gis de poliacrilamida
Radioistopos

2001: Genoma humano

Sanger Institute
Celera Genomics
(530 bases/min)

GENOMA NO BRASIL

PROJETOS GENOMA

Bioinformtica

COMPARAO COM
BANCOS DE DADOS
VERIFICAO DE HOMOLOGIA
COM GENES PREVIAMENTE SEQUENCIADOS

Proteoma
Levantamento quantitativo de protenas/peptdeos em uma
amostra para identificar mudanas de interesse

Proteoma

Genoma

Protenas e peptdeos

DNA

Dinmico

Esttico

Clulas e tecido especficos

Orgo especfico

Tecido foliar com inculo

Tecido foliar sem inculo

Extrao, fracionamento e purificao das proteinas

Proteinas
Gel de eletroforese 2D

Seleo dos Spots e

exciso
Digesto com proteases especificas (tripsina)

Espectrometria de Massa
Analise dos peptdeos
MALDI-TOF-MS

ESI-Q-TOF-MS/MS

Fingerprinting massa dos

peptdeos

Sequenciamento mltiplos
peptdeos

Identificao das
proteinas

Identificao das
proteinas

Bioinformtica

Predizendo seqncia de
peptideo

Predizendo Fingerprinting

Sequencia Genmica

4.2. Extrao de protenas

a

Figure 1. Distribution of isoelectric points of cvs. Gala (a) and Fuji (b) and
molecular weights of Gala (c) and Fuji (d) of proteins expressed at different
times after inoculation.

4.3 Preparo de gel 2-DE

Figure 3. Protein profiles of two-dimensional electrophoresis of extracts from leaf tissue of cvs.
Fuji (F) and Gala (G) at different times after inoculation.

Nas figuras aparecem as manchas totais detectadas, as manchas exclusivas de cada

tratamento (crculos azuis), e as manchas exclusivas concomitantes ao tratamento e
cultivar (crculos laranjas marcadas com seu nmero de coordenada - spot id -).

Figura 10: Gel de referncia bidimensional das protenas totais do tecido foliar da cv. Fuji,
extradas s 24 horas aps a inoculao com C. gloeosporioides. Os crculos azuis indicam as
sobreposies exclusivas ao tratamento, detectadas quando comparados os gis dos tratamentos da
cv. Fuji (ver Tabela 3); os crculos cor laranja (marcados com o nmero identificador da mancha spot ID) indicam as sobreposies exclusivas ao tratamento, e cultivar, concomitantemente
(ver Tabela 5). A marca L1 que aparece anotada sobre o gel, indica uma mancha usada como
referncia para alinhar os gis prvios s comparaes.

Figura 11: Gel de referncia bidimensional das protenas totais do tecido foliar da
cv. Fuji, extradas s 48 horas aps a inoculao com C. gloeosporioides. Os
crculos azuis indicam as sobreposies exclusivas ao tratamento, detectadas quando
comparados os gis dos tratamentos da cv. Fuji (ver Tabela 3); no foram detectadas
sobreposies exclusivas ao tratamento, e cultivar, concomitantemente (ver Tabela
5). A marca L1 que aparece anotada sobre o gel, indica uma mancha usada como
referncia para alinhar os gis prvios s comparaes.

Sem inculo

Com inculo (12 horas)

kd
116
66

45

29

20

4.0

7.0 4.0

7.0

kDa

Spot 24, 28, 29, 30, 31, 32, 77, 90, 93 and 96
Metalloproteinase (PIII) B.insularis

94,0-

Spots 255, 260, 261, 262 and 268

Metalloproteinase (PI) B.insuaris

67,0-

Spot 258
Serine proteinase B.
insularis

43,0-

Spot 386 and 394

Phospholipase A2 B. insularis
30,0-

Spot 356
Metalloproteinase
(Agkistrodon contortrix
laticinctus)

20.1-

Spot 412
Anticoagulant protein A
[Deinagkistrodon acutus]
Spot 428
Convulxin beta [Crotalus
durissus]

14.4-

Spot 444
Unnamed Protein Product (Mus Musculus)
433 e 434
Agkisacutacin B chain
[Deinagkistrodon acutus]

489
BJcuL precursor
[B. jararacussu].

Spot 375, 435 e 459

Spot 427, 429 e 467
Platelet
glycoprotein Ib-binding
Lectin [Bitis arietans]
protein alpha subunit [B.
jararaca]

Spot 474
Vascular endothelial
growth factor

4.4 Analise por espectrometria de massa dos spots

Variao do nmero total de spots, em funo do tempo aps a inoculao
com patgeno nas duas cultivares

Figura 2. Numero total de spots nas cvs. Gala e Fuji aps a

infeco pelo patogeno Colletothricum gloeosporioides nos tempos
de inoculao 0 (antes da inoculao) e 2, 4, 8, 12, 24, e 48 horas
aps a inoculao.

4.5 Obteno de protenas candidatas

Identificao de protenas exclusivas expressadas pelas cvs. Fuji e Gala em resposta ao ataque
pelo Colletotrichum gloeosporioides

Montagem de banco de dados de proteoma

Como funciona ?
Genomica Funcional

Genomica Estrutural
Bibliotecas cDNA

Bibliotecas subtrativas

DNA-Microarray

Protemica

BIOINFORMTICA

Gel Electroforese 2D
Espectrometria de Massa
Sequenciamento de Proteina

Sequncias X Forma X Funo =

RESISTNCIA

genes candidatos
estudo in loco da expresso

- Clonagem de gene da
mesma espcie ou
entre plantas

Produo de Plantas INTRAgnicas

- Isolar e clonar o gene de interesse
- Adicionar segmentos de DNA para iniciar ou
aumentar expresso do gene

- Introduzir a construo gnica em clulas de

plantas (transformao)

- Seleo de clulas ou tecidos transformados

- Regenerao de plantas

Tentativa de obteno de um gene especfico a ser clonado

e super expresso
Estudo da expresso deste gene clonado
Comprovao da funo do gene de
resistncia
FUGIR DOS ENTRAVES DA TRANSGNIA:
- Clonagem de gene de espcie diferente
- Vetor: Regio promotora viral
Regio de resistncia a antibitico

Construo de vetores para transformao

MpNPR
Kpn I

SacI

HindIII

BamHI

pIBI 11

35S e + 35S pr

Hind III

SacI

MpNPR

KpnI

EcoRI NcoI
35S polyA

BamHI

pIBI 21
35S
promoter

T-Border HindIII

MpNPR

35S
35S
polyA promoter

EcoRI

pIBI 23

bar

35S
polyA

T-Border

-MpNPR (gene
clonado de Malus
domestica,
homlogo ao NPR1
de Arabidopsis e que
controla a
resistncia sistmica
adquirida.
- genes candidatos
da prospeco de
genes.

R e p O rig in 1
R e p O r ig in 1

Construo do plasmideo
Clonagem dos genes bvlI em vetores de
expresso em planta
r ig h t b o r d e r o f T i-p l a s m id
r ig h t b o r d e r o f T i-p l a s m id
p r o m o te r o f th e n o s g e n e
S ig n a l p e p tid e
p r o m o te r o f th e n o s g e n e
S ig n a l p e p ti d e
kanR
kanR
3 'U T R o f t h e n o s g e n e
3 'U T R o f t h e n o s g e n e

te tR
te tR

BVL
BVL

3 5 S p r o m o te r
3 5 S p r o m o te r

pGA 643+ bvl I

pGA 643+ bvl I
12 2 9 9 b p
12 2 9 9 b p

te tA
te tA

X ba I (28 30 )
X ba I (28 30 )

bv l I
bv l I

B g l II (35 5 6 )
B g l II (35 5 6 )

tr fA
tr fA

te r m i n a to r s e q u e n c e o f T -D N A g e n e 7
te r m in a to r s e q u e n c e o f T -D N A g e n e 7
3 'U T R o f T - D N A g e n e 5
3 'U T R o f T - D N A g e n e 5
le ft b o r d e r o f T i-p la s m id
le ft b o r d e r o f T i-p la s m id
in c P o r ig in o f tr a n s fe r
in c P o r ig in o f tr a n s fe r
tr a J
tr a J

bvl I
bvl I

879 bp
879 bp

Introduzir a construo gnica em

clulas de plantas (transformao)
T-DNA

Gene de
interesse

Clula
vegetal
A.
tumefaciens

Clula
transformada

Cultivo de
clulas
Regenerao

Planta
transgnica

Sele
o

Adaptado de Griffiths et al., 2000

Identificao e seleo de explantes

Genes indicadores
Como h restries ao desenvolvimento de plantas geneticamente
modificadas com genes de seleo que conferem resistncia a antibiticos.
Assim, o uso do gene npt II no recomendvel devido grande polmica
gerada em inmeros pases importadores de produtos agrcolas.
gus A
- glucuronidase

gfp
protena de
fluorescncia verde

Alternativas:
-glufosinato de amnio
resistncia obtida pela
enzima PAT codificada pelo
gene bar,
-manose - metabolizada
pela enzima PMI codificada
pelo gene bacteriano pmi)
que favoream a obteno
de plantas transgnicas e
diminuam a freqncia de
escapes

Transformao Gentica

Expl. Foliares

Lavagem

Insero em Agrobactrium

Meio Regenerao

Expl.

Co-cultivo

Figura 2- Explantes foliares e brotaes de macieira cv. Gala aps a inoculao por A. tumefaciens
utilizando o Protocolo P1. (A) Explantes foliares aps a infeco em meio de co-cultivo. (B) Controle
negativo, com canamicina 50 mg L-1. (C) Controle positivo, sem canamicina. (D) Brotao infectada por A.
tumefaciens aos 60 dias cultivada em meio MS com 2 mg L -1 de 2iP. (E) Brotos em meio de multiplicao
com 90 dias de cultivo, suplementado com 0,1 mg L -1 ANA + 8,3 mg L-1 de 2iP. (F) Clones de brotaes
sobreviventes em meio de multiplicao com canamicina 50 mg L -1.

01

02

03

04

05

06

07

08 09

10

11

Figura 2. Gel de agarose com 11 eventos de transformao em amplificao de

800 pb de bvll .

REGENERAO DE PLANTAS

Organismos geneticamente
modificados
...alien
hospedeiro
com
fisionomia
peonhenta.
..

Avaliao das plantas geneticamente modificadas

Epagri, SC

Epagri, SC e ABPM

Scab lesions on a leaf of a transgenic McIntosh line

T564 (A) compared to those on susceptible nontransgenic McIntosh leaf (B).
Photos courtesy of Jyothi Prakash Bolar, Cornell
University.

Transgenic Royal Gala apple line (left) expressing

attacin has significantly enhanced resistance to fire
blight compared to the non-transgenic (right).
Photo courtesy of Herb S. Aldwinckle, Cornell
University.

Transferncia Genmica
Parcial
Controle do processo da
transferncia genmica
parcial usando
microprotoplastos,
micromanipulao,
citometria de fluxo,
hibridao in situ

Ma: Modelo das Rosaceae

Macieira diploide 2n= 34
BAG (Geneva 3909; Caador - 460 acessos)
Genoma: 750 Mb or 1.54 pg DNA/2C
Mapas genticos de ligao ~ 840 marcadores (RAPDs,
AFLPs e SSRs)
Estratgia de clonagem baseada em mapa bem
sucedida
Sistema de transformao e regenerao de linhas
transgnicas para multiplas cultivares de macieira
Bibliotecas de BAC (bacterial artificial chromosome)
200.000 ESTs (expressed sequence tags)

DESAFIOS
Diminuir a utilizao de produtos qumicos para controle de
pragas e doenas;
Obter uma alta produtividade de frutos sadios;
Exigncia dos consumidores por alimentos de melhor
qualidade,
Preservao do meio ambiente, exige mudanas nas
tecnologias adotadas para a produo de frutas de alta
qualidade biolgica;
Seleo de cultivares resistentes de fundamental
importncia para a sustentabilidade do setor produtivo;
Possibilidade de reduo do uso de fungicidas nos frutos em
crescimento, situao adequada para produo ecolgica
e/ou integrada de frutas.

CONSTRUO
Construo do dilogo
Integrao das
competncias
Rede de Pesquisa
Construo das
Parcerias (Univ. X
Empresas)

Genericamente teremos uma representao grfi

Cincia Tecnologia Produto

Produo

Tempo

Possveis patentes genmicas

MUITO OBRIGADA !