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UNIVERSIDAD POLITCNICA DE PUEBLA

GENERAMOS CIENCIA Y TECNOLOGA


Protocolo

Insercin del NisB para la produccin de Nisina en


la bacteria de E. coli
PUEDEN HACER MAS ESPECIFICO EL TITULO.
Presenta
Carrillo Jimnez Nayeli
Huerta Rojas Brenda
Fecha

Antecedentes, NO SON ANTECEDENTES ES


INTRODUCCION O GENERALIDADES..
La nisina es el antibitico usado a nivel comercial en diversos
productos alimenticios la cual es producida por Lactococcus
lactis ssp. Debido a que no se han reportado mecanismos de
resistencia por las bacterias sensibles, se utiliza ampliamente
como conservador a nivel mundial. La biosntesis de la nisina
est controlada por un conjunto de 11 genes que codifican el
precursor as como las enzimas necesarias para modificarla y
secretarla, entre otras funciones. NisB es la primera enzima
que acta sobre el precursor deshidratando aminocidos
clave.
Demasiada letra, hay que disminuir y reducir la parte
introductoria.

Estos
son
sus
complementar

antecedentes,

hay

que

En la industria alimentaria la nisina se usa


principalmente en la elaboracin de quesos, pero en
un estudio reciente se ha demostrado la eficacia de
esta sustancia para el almacenamiento de carne de
ternera en envases activos. (D. Ercolini et al 2010)
HAY QUE COMPLEMENTAR CON LOS ARTICULOS QUE
HAN REVISADO..

E. coli

Introduccin
???????

Se puede aislar en agar Eosina y


Azul de metileno, MacConkey.
Se puede aislar de hortalizas, pero
tambin se encuentra en los
intestinos de mamfero sanos.
Cmo?..... ESTO ES
ANTES NO VAN A AISLARLA,
TOMEN EN CUENTA QUE ESTA NO
ES CUALQUIER CEPA, ES UNA CEPA
MUY ESPECIFICA. CUAL ES??...

Lactococcus lactis
Bacteriano
mvil,Gram +

esporulante,no

Usada
extensamente
en
produccin demantecayqueso

la

Es un anaerobio facultativo que


convierte los carbohidratos en cido
lctico por fermentacin de cido
lctico.
ESTO TAMBIEN VA EN INTRODUCCION
DESDE EL INCIO

Justificaci
Esten
antibitico ( es un antibitico????.... Chequen la denominacin de
este tipo de sustancias, porque es incorrecto el termino). natural es
el primer conservante natural del que se sabe que mata bacterias
Gram-negativas, las cuales suelen ser nocivas. El antibitico puede ser
til para proteger a los alimentos de una amplia gama de patgenos
que causan enfermedades.
El antibitico podra ser usado para evitar la presencia de bacterias
perniciosas en carnes, quesos procesados, productos lcteos y de
huevo, alimentos enlatados, mariscos, condimentos, bebidas
fermentadas y muchos otros alimentos. Adems de sus beneficios
para la seguridad alimentaria, los antibiticos son fciles de digerir, no
resultan txicos para los humanos, no provocan alergias y es difcil
que las bacterias peligrosas desarrollen resistencia a ellos. Por lo que
en este trabajo se pretende
no estn considerando los pormenores de los que deriva el desarrollo

Objetiv
os

Identificar el gen de produccin de Nisina (antibitico?????) es producida


por Lactococcus lactis ssp ???? Esto que es.. para ser introducida
a Escherichia coli aja, y..
aqu mismo pueden colocar los objetivos especficos.. No ocupen otra
diapositiva

Objetivos Particulares o
Especficos
Obtener el gen NisB para, de donde o porque
Disear un primers para que????.
Insertar un gen( cual, ya lo tienen, den el nombre????, en el
vector de clonacin estableciendo la enzima NisB. Como??????
Clonar el gen en una clula hospedera. Cual?....
Demostrar la funcionalidad de quien?????
Realizar el corrimiento electrofortico para determinar Como o
para que??????,
Corroborar que el gen se inserto por PCR ok y para que???
Y las tcnicas de transformacin??.....

Metodolog
a
Bsqueda del
en el genoma.

Diseo de
oligonucletido
s para la
amplificacin
por PCR en el
gen ??????.

Obtencin Insertar
del gen por gen
en
PCR
vector

el
el

Transformacin
de la
construccin en
la clula
hospedadora.
Como lo
harn????
Que Verificacin
Seleccin
de las
clonastecnia???::: de las clonas
transformantes.

Se utilizara la
tcnica de
conjugacin???
??? para
transferir el
gen

Tcnicas de ADN recombnate.????

Conjugacin ,. Y esto para que

Para introducir el fragmento del gen utilizaramos un Helper


es???........

para Lactococcus lactis y ser introducido a E. coli.???????.....


Con un mecanismo horizontal de genes.
En un placa Petri con medio como colocar la clula donadora.
Luego colocar el Herper
Posteriormente colocar la clula receptora????
Verificar si se inserto correctamente el gen.?????
Nota: entre cada siembra esperar que seque para poder colocar
la siguiente muestra.?????
NO ENTIENDO LO QUE ESTAN PROPONIENDO?????????

Hospedad
or
Utilizar cepa de E. coli K12 para
poder por la amplia investigacin
que tiene esta cepa es fcil de
manipular y se han tenido resultados
favorables.

Tipo de
PCR
PCR
en tiempo real.
Ya q nos va a permitir cuantificar en forma absoluta la cantidad
ADN de que????
Se utilizaran sondas de hidrolisis ya que este nos va a permitir el
aumento de la seal del reportero y este a su vez el incremento
proporcional del amplicn.
Para la deteccin de la cantidad de ADN especfico se emplearan
sondasunida a dosfluorocromos que hibrida en la zona
intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso
(reverse), cuando la sonda est intacta, presentan una
transferencia energtica de fluorescencia por resonancia
(FRET).???????????
Y ESTO???... PARA QUE ES??... NO DEBEN DESCRIBIR LA TECNICA,

Procedimientono es necesario dar


seguimeinto, la tcnica es mas que claro
que deben saber el orden y por tanto
como se realiza, mas no que deban
incluirla es su presentacin..

1.Realizar la extraccin
2.Cuantificar y diluir el ADN
3.Preparara la mezcla de reaccin
4.Preparacin de los controles
5.Colocar la mezcla de reaccin y el ADN en la placa para la
PCR.
6.Amplificacin por la PCR del fragmento ADN y del gen de
inters.
7.Obtencin de datos.

JERAQUIA DE PRESENTACION.
INTRODUCCION O GENERALIDADES
ANTECEDENTES
JUSTIFICACION
OBJETIVOS (GENERAL Y ESPECIFICO, EN UNA SOLA DIAPOSITIVA)
DIAGRAMA DE TRABAJO GENERAL
RESULTADOS DE INVESTIGACION Y PROPUESTA DE TRABAJO IN VITRO
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
Es el orden que deben considerar con lo que estn realizando. Tienen la
informacin revuelta,en orden incorrecto y no presentan nada del anlisis de
secuencia de su gen, sitios de restriccin y cortes a realizar, vector a utilizar,
Diseo de primers, condiciones de amplificacin y tamao de fragmento esperado,
condiciones de electroforesis, etc..

Referencias.???????.