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Paulo Edson

Fernandes
paulofernandes@live.
com

BIOTECNOLOGIA FARMACUTICA
Aula 04

Tecnologia do DNA Recombinante Parte 2

Trabalho
Semanal
Pequeno questionrio semanal
Pesquisas simples de
conceitos e aplicaes prticas
50% da 1 V.A. - Aprox. 8
trabalhos
Entrega no dia = 100% da
nota;
Entrega atrasada = 80% da
nota.
Essa semana: Pesquise e
responda em 9 linhas:

Resumo Rpido da Aula


Anterior

A tecnologia do DNA engloba uma


srie de procedimentos para extrair,
fragmentar,
sintetizar,
marcar,
identificar, amplificar e sequenciar o DNA.

Tecnologia do DNA
Recombinante

Estas tcnicas foram desenvolvidas ao


longo de uma dcada (1985-1995),
constituindo hoje um conjunto de
ferramentas
que

utilizado
rotineiramente
nos
laboratrios,
geralmente em sistemas automatizados
especialmente desenhados para efetuar
rapidamente um nmero altssimo de
operaes.

Tecnologia do DNA
Recombinante

A
extrao
de
DNA

um
procedimento relativamente simples.

De um modo geral, a quebra de


paredes e membranas libera o
contedo celular, do qual se
eliminam o RNA e as protenas antes
de separar o DNA, que se precipita
com etanol.

Uma vez extrado e purificado o


DNA, diversos tipos de tratamento

Tecnologia do DNA
Recombinante

Pelo
menos
30
de
empresas
j
comercializam diferentes tipos de kits
para a extrao de cidos nucleicos,
substituindo os protocolos tradicionais
por
sistemas
mais
fceis
de
automatizar.

Estima-se que este mercado alcance um


valor de US$ 158 bilhes, em 2014.

Enzimas de Restrio

Este tipo de enzima atua como uma


espcie de "tesoura biolgica"
que, aps reconhecer determinada
sequncia nucleotdica, faz um corte
na molcula de DNA, produzindo
fragmentos. Elas so produzidas
naturalmente por bactrias como
forma de defesa contra infeco
viral.

Tipos de Enzimas de
Restrio
Tipo II

Duas enzimas:

1 enzima de restrio (Endonuclease)


1 enzima de metilao (Metilase)
Estrutura Simples
Sequncia de reconhecimento palindrmica 4-8nts
No necessita de ATP, apenas Mg2+

Importantes na recombinao gentica e na elaborao


de mapas de restrio (especificidade de corte)

Enzimas de Restrio

O stio de reconhecimento das


enzimas de restrio do Tipo II
normalmente uma sequncia
palindrmica, ou seja, apresenta a
mesma leitura nos dois filamentos,
mas em direes
Exemplo:
5' G A Aopostas.
T T C 3'
3' C T T A A G 5'

A enzima de restrio
corta aqui...

GA A T T C

GA A T T C

CT T AAG

CT T AAG
e aqui...

O corte feito em ziguezague

AAT TC

CT T AA

Extremidades soltas

CT T AA
As fitas se separam

AAT T C

CT T AA

AAT TC

Extremidades soltas

AAT T C

CT T AA

A extremidade solta das duas molculas se ligam

D
G A A T T C

C T T A A G

Ligao Enzimtica

Embora
os
filamentos
complementares permitam que as
molculas
se
liguem
por
complementaridade de bases, as
sequncias acar fosfato ainda no
esto completas nas duas posies
de cada juno. Para selar esta
ligao, so utilizadas enzimas como
a ligase.

Ligao Enzimtica

As
ligases
so
capazes
de
catalisar
a
formao
de
pontes fosfodister
ao final das fitas de
DNA.

A
enzima
responsvel
por

Sntese e Amplificao do
DNA

Sntese de oligonucleotdeos
A sntese de oligonucleotdeos de DNA e
RNA se desenvolve hoje em mquinas
automatizadas (sintetizadores) capazes de
construir, em poucos minutos, molculas
com dezenas de pares de bases.
Estes oligonucleotdeos podem ser utilizados
como sondas ou como primers para a PCR
(veremos um pouco mais adiante).

Sntese e Amplificao do
DNA

Sntese de oligonucleotdeos
A sntese de oligonucleotdeos de DNA e
RNA se desenvolve hoje em mquinas
automatizadas (sintetizadores) capazes de
construir, em poucos minutos, molculas com
dezenas de pares de bases
Estes oligonucleotdeos podem ser utilizados
como sondas ou como primers para a PCR
(veremos um pouco mais adiante).

Sntese e Amplificao do
DNA
Sntese de oligonucleotdeos

Sntese e Amplificao do
DNA

Sntese de cDNA
Uma enzima de origem viral transcreve a
informao gentica no sentido RNA DNA.
Esta enzima, denominada transcriptase
reversa, normalmente garante aos vrus
com genoma de RNA sua multiplicao no
hospedeiro (como o HIV, por exemplo).

Sntese e Amplificao do
DNA

Sntese de cDNA
Como
ferramenta
de
laboratrio,
a
transcriptase
reversa
possibilita
a
construo
de
filamentos
de
DNA
complementares
(cDNA)
a qualquer
molcula de RNA.

Sntese e Amplificao do
DNA

Sntese e Amplificao do
DNA

A reao em cadeia da polimerase


A reao em cadeia da polimerase
(Polymerase Chain Reaction ou PCR) um
procedimento que permite obter milhes de
cpias de DNA em poucas horas.

Sntese e Amplificao do
DNA

A reao em cadeia da polimerase


Para isso, se precisa do DNA que contenha a
sequncia que se deseja amplificar, de
desoxinucleotdeos dos quatro tipos (dATP,
dTTP, dCTP e dGTP), de uma polimerase de
DNA e dos primers correspondentes.
Estes so pequenos fragmentos sintticos de
DNA, complementares s extremidades da
sequncia -alvo, sendo indispensveis para
que a polimerase comece a sintetizar o

Sntese e Amplificao do
DNA

A reao em cadeia da polimerase


A chave do processo a DNA-polimerase,
uma enzima estvel a altas temperaturas que
permite bactria
Thermus aquaticus
sobreviver em guas termais. Atualmente,
esta enzima
se produz por engenharia
gentica.

Sntese e Amplificao do
DNA

A reao em cadeia da polimerase


Em um ciclo pontuado por mudanas de
temperatura, os filamentos de DNA so
dissociados e anelados com os primers,
possibilitando que a polimerase sintetize o
resto da sequncia.
Repetindo muitas vezes o ciclo, gera-se em
pouco tempo um nmero altssimo de
cpias
que
podem
ser utilizadas em
qualquer tipo de anlise.

Sntese e Amplificao do
DNA
A reao em cadeia da polimerase

Sntese e Amplificao do
DNA
A reao em cadeia da polimerase

Sntese e Amplificao do
DNA

A reao em cadeia da polimerase


Uma mquina de PCR pode desenvolver 25
ciclos em menos de uma hora, amplificando
105 vezes o fragmento de DNA.
Uma das grandes vantagens da PCR que
no h necessidade de isolar previamente o
fragmento a ser amplificado, bastando
conhecer as extremidades da sequncia e
escolher os primers adequados.

Sntese e Amplificao do
DNA

A reao em cadeia da polimerase


A empresa Cetus comprou de seu
inventor, K. Mullis, a patente da PCR por
U$S 10.000, vendendo-a pouco tempo depois
a Hoffmann-La Roche por U$S 300 milhes;
hoje se trata de uma tcnica corriqueira em
qualquer laboratrio de Biologia Molecular e
provavelmente nenhum dos dois fez um bom
negcio.
Mais tarde, em 1993, Mullis recebeu o Prmio

Sntese e Amplificao do
DNA

A reao em cadeia da polimerase


O sucesso da PCR se deve a sua
extraordinria versatilidade, permitindo que
seja utilizada, com objetivos diversos, em
campos to diferentes como a agricultura, a
medicina veterinria, os estudos ambientais,
os testes de diagnstico e a medicina forense.
Entre suas muitas aplicaes, cabe citar
tambm
os
estudos
antropolgicos
e
evolutivos, tais como a extrao de DNA de
mmias egpcias, de animais extintos como o

Vetores de Clonagem

O vetor ideal deve reunir em uma molcula


diversas caractersticas, como:

I - Ser uma molcula pequena e de fcil


manipulao;

II Ser capaz de se replicar de forma


autnoma e intensa, o que permite a
amplificao do fragmento de interesse;

Vetores de Clonagem

III- Deve conter diferentes sequncias


que permitam o reconhecimento por
enzimas de restrio;

IV- Ter um mtodo fcil e rpido de


identificao de clones que portam o
vetor recombinante.

Vetores de Clonagem

Atualmente, esto disponveis no


mercado diversos tipos diferentes de
vetores que permitem que o
procedimento de clonagem seja
realizado.

A escolha entre eles depende


basicamente das caractersticas do
inserto e da aplicao pretendida
para o gene clonado.

Tipos de Vetores
Vetores

Plasmdeos
Cosmdeos

Bacterifagos

Hospedeiro
s
Bactrias / leveduras

Utiliza
o
clonagem

Plasmdios

Plasmdeos so molculas circulares


de DNA pequenas
(de 2.000 a
200.000
pares
de
bases)
encontradas em muitas bactrias.

VETORES PLASMIDIAIS

Plasmdios

Possuem fita dupla, extracromossomais, que


ocorrem naturalmente em bactrias e
algumas leveduras

pUC18
pBR322
pUP310

Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de at 9 kb

Plasmdios

Plasmdio: DNA extra cromossmico,


no
essencial,
que
confere
vantagens bactria

Plasmdios podem ser utilizados


como
vetores,permitindo
a
reproduo de um DNA estranho
usando o sistema de replicao
bacteriana.

Plasmdios

Bacterifago
-

Vrus que infectam bactrias;

- DNA ou RNA;
- Capsdeo
- Biologia do fago
- Utilizados para clonar fragmentos de
9kb a 25 kb

Cosmdeos
- So hbridos
bacterifagos;

entre

plasmdios

- Utilizados para clonar fragmentos de 25


a 35 kb;

Cromossomo Plasmdio
Bactria
Gen de interesse
Plasmdio recombinante inserido na bactria

Cpias do gene

Produo
de plantas
resistentes
a pragas

Cpias da protena

Produo de
hormnio de
crescimento
Produo de bactrias
especializadas
na
limpeza de resduos

Produo de fator de
coagulao, insulina e
outros frmacos.

Biblioteca Gnica

Uma das mais importantes aplicaes da


clonagem molecular a possibilidade de
se ter fragmentos de DNA de todo o
genoma de um organismo clonado em
plasmdeos, o que constitui a chamada
biblioteca gnica.

Ela
representa
uma
coleo
de
plasmdeos contendo fragmentos que
suficiente grande para garantir que todo
o DNA genmico seja produzido pelo

Biblioteca Gnica
1

DNA Humano
(genoma)

Milhes de fragmentos do
DNA genmico

Clivagens com enzima


de restrio

Molculas de DNA
recombinante

Introduo dos
plasmdios nas
bactrias

Molculas de DNA
recombinante

Fragmentos de
DNA inseridos
nos plasmdios

Aplicaes

Farmacologia: fabricao de produtos


farmacuticos como a insulina, hormnio
de crescimento, fatores de coagulao,
drogas para AIDS, cncer etc.

Bactrias Especializadas: Para limpar


mancha de petrleo nos oceanos,
diversos
processos
industriais
na
produo de etanol, tratamento de
esgotos etc.

Aplicaes

Setor Produtivo Agrcola: Plantas


transgnicas
(milho,
soja,
algodo,
batata, melancia, abbora etc.)

Terapia Gnica: Transferncia direta de


genes em humanos para tratar uma
doena . Os vetores geralmente usados
so
os
retrovrus
geneticamente
modificados.

Aplicaes

Mapeamento Gnico: determina a


presena de genes responsveis por
vrios distrbios humanos atravs de
marcadores
genticos
(DNA
radioativamente marcado).

Fingerprintingde DNA:
consiste no
uso de DNA para identificar uma pessoa,
sendo um poderoso instrumento para
testes de paternidade, investigaes