ENZIMOLOGIA CLNICA

REVISIN DE CONCEPTOS
BASICOS
Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza
proteica (ribozima, RNA cataltico)
Aceleran reacciones bajando la energa de
activacin
No modifican la Keq, solo disminuyen el tiempo
en se alcanza el equilibrio

Reduccin en la energa de activacin GEA << GA que

con y sin catalizador enzimtico.
A, estado activado (tambin *); EA activacin enzima; ES, Enzima
sustrato; G, energa; P, producto; S, Sustrato.

CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS

POR SU COMPOSICIN
* simples
* conjugadas : apoenzima + cofactor
(holoenzima)

cofactores
Organicos

inorganicos

Fuertemente
unidos
Gpo.
prosttico

Dbilmente
unidos

Hemo

NAD

(peroxidasa)

(LD)

Cu
Cl
(ceruloplasmi (AMS)
na)

PPT

Zn

(ALT, AST)

(anhidrasa
carbnica)

Coenzimas

Fuertemente
Dbilmente
unidos
unidos
metaloenzimas activadores

Mg

Clasificacin y nomenclatura de enzimas

1. Oxidorreductasas
2. Transferasas
3. Hidrolasas
4. Liasas
5. Isomerasas
6. Ligasas

Comisin de Enzimas (EC)

de la Unin Internacional de
Bioqumica (IUB)

Nombre sistemtico:

Grupo transferido

ATP: hexosa fosfotransferasa

Donador

Aceptor
Grupo Subgrupo

Nmero sistemtico
Enzyme
Comission

EC 2.7.1.1

Nombre comn: Hexokinasa

Sub-subgrupo

Enzima

Nomenclatura alternativa en oxidorreductasas:

1. Deshidrogenasas

2. Oxidasas
3. Peroxidasas
4. Oxigenasas
5. Hidroxilasas
6. Reductasas

Los subgrupos se forman segn la

naturaleza del dador:
1.1.-.- Sobre grupos alcohol
1.2.-.- Sobre grupos aldehdo
1.3.-.- Sobre grupos -CH-CHetc.

Nombre trivial: Lactato deshidrogenasa

Cdigo EC: 1.1.1.27
Abreviatura: LD, LDH
Nombre sistemtico:
L-lactato: NAD+ oxidorreductasa

Clasificacin de las transferasas

2.1.-.- Grupos monocarbonados
2.2.-.- Grupos aldehido o ceto
2.3.-.- Aciltransferasas
2.4.-.- Glicosiltransferasas
2.5.-.- Alquil- o Ariltransferasas
2.6.-.- Grupos nitrogenados
2.7.-.- Grupos fosfato
2.8.-.- Grupos sulfato

Nombre trivial: -glutamiltransferasa

Cdigo EC: 2.3.2.2
Abreviatura: GGT
Nombre sistemtico:
(5-glutamil)-peptido:aminocido 5glutamiltransferasa

Nombre trivial: Aspartato aminotransferasa

Transaminasa oxalactica
Cdigo EC: 2.6.1.1
Abreviatura: AST, SGOT, TGO
Nombre sistemtico:
L-aspartato: 2-oxoglutarato amino
transferasa

Nombre trivial: Alanina aminotransferasa

Transaminasa pirvica
Cdigo EC: 2.6.1.2
Abreviatura: ALT, SGPT, TGP
Nombre sistemtico:
L-alanina: 2-oxoglutarato amino
transferasa

Nombre trivial:

Creatinquinasa

Cdigo EC: 2.7.3.2

Abreviatura: CK
Nombre sistemtico:
ATP: creatina N-fosfotransferasa

Clasificacin de las hidrolasas

3.1.-.- Esterasas (carboxilesterasas, fosfoesterasas, sulfoesterasas)

3.2.-.- Glicosidasas
3.3.-.- ter hidrolasas
3.4.-.- Pptido hidrolasas
3.5.-.- Acil anhdrido hidrolasas
etc.

Nombre trivial:

Triacilglicerol lipasa
Lipasa

Cdigo EC: 3.1.1.3

Abreviatura: LPS
Nombre sistemtico:
Triacilglicerol acil hidrolasa

Nombre trivial:

Fosfatasa alcalina

Cdigo EC: 3.1.3.1

Abreviatura: ALP
Nombre sistemtico:
Monoester ortofosfrico fosfohidrolasa
(pH ptimo alcalino)

Nombre trivial:

Fosfatasa cida

Cdigo EC: 3.1.3.2

Abreviatura: ACP
Nombre sistemtico:
Monoester ortofosfrico fosfohidrolasa
(pH ptimo cido)

Nombre trivial:

5-nucleotidasa

Cdigo EC: 3.1.3.5

Abreviatura: NT
Nombre sistemtico:
5-ribonucletido fosfohidrolasa

Nombre trivial:

-amilasa, Diastasa

Cdigo EC: 3.2.1.1

Abreviatura: AMS
Nombre sistemtico:
1,4--D-glucano glucanohidrolasa

Algunas reacciones lisicas:

(grupo 4)

- Descarboxilasas

- Aldolasas
- Anhidrasa carbnica
- Adenilato ciclasa

Grupo 5: Isomerasas
Catalizan reacciones de isomerizacin
Algunas reacciones isomersicas:
- Racemasas
- Oxidorreductasas intramoleculares
- Mutasas o transferasas intramoleculares

Algunas reacciones ligsicas:

(grupo 6)
- Aminoacil-tRNA sintetasas

- Glutamina sintetasa
- Carboxilasas

CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS

POR SU LOCALIZACIN

- Plasma-especficas: CHE, Factores coagulacin

- Celulares
* Membranales: ALP, GGT, 5N
* Mitocondriales: CK, AST
* Citoplasmticas: LD, CK, AST, ALT
* Lisosomales: ACP
- De secrecin: AMS, LPS

ORGANOESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS E

ISOENZIMAS
LD: LD 1,2,3,4,5
CK: MM, MB, BB
ALP: Heptica, sea, placentaria,
otras
ACP prosttica, eritrocitaria, otras
AML: pancretica, salival
AST: mitocondrial y citoplasmtica
CHE: isoformas mono, di y
tetramrica

ISOENZIMAS

Son ismeros de una familia de enzimas que catalizan la misma

reaccin qumica

Cada isoenzima posee una afinidad diferente por el sustrato y

cofactores

Difieren en la capacidad de ser inhibidas por agentes especficos,

en sus propiedades fsicas (termoestabilidad y carga), composicin
de aminocidos e inmunoreactividad

No difieren en su tamao molecular

Isoenzimas

LD

Tetrmero: 4 Subunidades H (heart) y M

(msculo)
LD1 (HHHH H4, corazn, rin)
LD2 (HHH H3M, rin, cerebro)
LD3 (HHMM H2M2, pulmn, bazo)
LD4 (HMMM HM3, bazo)
LD5 (MMMM M4, hgado, msculo, piel)

Isoenzimas

CK

Dmero: subunidades M (musculo) y B (cerebro)

CK-MM (msculo esqueltico)
CK-MB (corazn)
CK-BB (cerebro)

MTODOS DE ANLISIS DE ISOENZIMAS

Electroforesis (todas)
Cromatografa de intercambio inico (CK, LD)
Inmunoinhibicin (CK, LD, ACP)
Radioinmunoanlisis (CK, LD, ACP)
Termoestabilidad (ALP)
Inhibicin cataltica (ACP, ALP, CHS)
Especificad de sustrato (LD1)

MTODOS DE ANLISIS DE LAS

ENZIMAS
Por sus propiedades catalticas (actividad) o
inmunoquimicas (cantidad)
Directos o acoplados
Punto final o cinticos
Dependiendo de la longitud de onda utilizada, se pueden
clasificar en colorimtricos y UV
Dependiendo del grado de evolucin se pueden
clasificar en NO OPTIMIZADOS Y OPTIMIZADOS

MTODOS OPTIMIZADOS PARA EL

ANLISIS DE ENZIMAS
No se necesita un tratamiento previo de las
muestras
Generalmente son de dos pasos
Despus de un anlisis exhaustivo, tienen las
mejores condiciones para proporcionar la
mxima sensibilidad, especificidad y calidad

 Espectros de absorcin,
Abs., de NAD+ 5 x 10 -5 M
en amortiguador de Tris
0.1 M, pH 7.5 (lnea
punteada)
Espectro de absorcin de
NADH 4 x 10-5 M en
amortiguador Tris 0.1 M,
pH 9.5 (lnea continua).

MTODOS OPTIMIZADOS PARA EL

ANLISIS DE ENZIMAS

IFCC (International Federation of Clinical Chemistry)

DGKCH (Deutsche Gesellschaft fr klinische chemie)
SFBC (Societ Francaise de Biologie Clinique)
SCE (Scandinavian Comittee on Enzymes)
NVKC (Nederlandse vereniging voor klinische
chemie)

SEQC (Sociedad espaola de bioqumica clnica)

RECOMENDACIONES INTERNACIONALES
PARA LA CUANTIFICACIN DE ENZIMAS
Utilizar mtodos optimizados, de
preferencia de la IFCC
Utilizar fotmetros con:
ancho de banda pequeo
Temperatura regulada
Celda cuadrada
Capacidad para leer en el UV
Lecturas digitales

MTODOS DE ANALISIS DE LAS

ENZIMAS

Todos los mtodos actuales, que se utilizan en

Mxico, miden actividad enzimtica

En otros pases ya se utilizan mtodos que

miden cantidad de enzimas

Para medir la actividad necesariamente se

deben medir mtodos cinticos

MTODOS DE ANALISIS DE LAS

ENZIMAS

Las tcnicas inmunoquimicas garantizan la

actividad de enzimas que han perdido su
actividad

MTODOS DE ANALISIS DE LAS

ENZIMAS
La actividad enzimtica puede ser afectada por
la concentracin del substrato y cofactores; pH,
fuerza inica y la presencia de inhibidores
Los mtodos optimizados garantizan las
mejores condiciones de todo

Tpica reaccin enzimtica con fase inicial, cambio

lineal, y fase de agotamiento del sustrato. La actividad
enzimtica es la pendiente de la fase lineal.

Desarrollo en el tiempo de
una reaccin enzimtica
con tres cantidades
diferentes de enzima
presente.

curva A: alta actividad, la

fase inicial disminuye, la
fase lineal disminuye, y el
consumo de sustrato
ocurre ms pronto
B: actividad media
C: baja actividad.

Cintica enzimtica

Cintica enzimtica

Ecuacin de Michaelis-Menten
Vmx [S]
v =
Km + [S]

[S]=10Km entonces v = 0.91 Vmax

Vmx(10 x Km)
10 x Km
v = = Vmx = 0.91 Vmx
Km + (10 x Km)
11 x Km

Transformacin de Lineweaver-Burk
Representacin lineal de la ecuacin de
Michaelis-Menten
La pendiente es Km/Vmax
La abscisa en el origen (1/Vo = 0) es -1/Km
La ordenada en el origen (1/[S]o = 0) es 1/Vmax

COMENTARIOS PARA LA CUANTIFICACIN DE

ENZIMAS

Si se utilizan mtodos optimizados, la

calidad de la medicin depende de:
Temperatura (Q10)
Lecturas en tiempos exactos
Medicin de Vm (velocidad maxima)

COMENTARIOS PARA LA CUANTIFICACIN DE

ENZIMAS
La Vmax corresponde a la fase de la reaccin
en la cual es constante la aparicin del producto
en funcin del tiempo
En Vmax los incrementos de la absorvancia por
minuto deben ser semejantes
En muestras con gran actividad enzimtica se
alcanza pronto el equilibrio y la Vmax dura muy
poco

COMENTARIOS PARA LA CUANTIFICACIN DE

ENZIMAS
Un buen fotmetro garantiza el control riguroso
de la temperatura y toma de lecturas en tiempos
exactos
Habr que saber si se necesita preincubar la
muestra y reactivo, lo que depende de la
eficiencia del instrumento
con mtodos optimizados y un buen fotmetro,
la calidad depende de que se mida Vmax

ACTIVIDAD ENZIMATICA
Comisin de enzimas
1 UI = 1mol/min
(cantidad de enzima que convertira un micromol
por minuto, de sustrato en condiciones
estandarizadas)

Sistema Internacional (SI)

katal = 1 mol/seg

ACTIVIDAD ENZIMTICA
1UI =

micromol
min

10 -6
micromol

1 UI = 1.67 x 10-8 = 16.7 nK

1 min
60 seg

mtodo alternativo:
depende de tener un espectrofotmetro
calibrado apropiadamente.
a 340 nm, el NADH tiene un coeficiente de
absorcin molar:
A/(l x c) = 6.22 x 103 L mol-1 cm-1
Actividad enzimtica U/L

MTODOS / EJEMPLOS
AML
Almidn + I2

almidn- I2

punto final
colorimtrico
directo
no optimizado

AML
PNP-maltoheptasido PNP + sacridos
cintico
colorimtrico
directo
no optimizado

MTODOS / EJEMPLOS
LD
Piruvato + NADH

lactato + NAD

cintico
UV (340 nm)
directo
optimizado