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2.

ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS


PROTENAS
PURIFICACIN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA
DE MSCULO ESQUELTICO DE POLLO
PARTE I. EXTRACCIN Y PRECIPITACIN POR DESALADO

Las funciones biolgicas de las protenas


Las protenas tienen diferentes funciones:
Enzimas (Actividad cataltica)
Receptores de membrana
Acarreadores de membrana (Reconocimiento, actividad
cataltica y transporte)
Estructurales (Andamios moleculares)
Hormonas
Anticuerpos
Transporte

Purificacin de Protenas

La purificacin de protenas es un proceso mediante el


cual se separa una protena a partir de una mezcla compleja.

Para la purificacin se toman en cuenta las propiedades


fisicoqumicas y se hace mediante mtodos de
cromatogrficos en un proceso paulatino.

El mtodo de purificacin debe disearse tomando en


cuenta la cantidad de protena que queremos obtener
(rendimiento). Este rendimiento depende del uso que se le
desea dar.

Podemos obtener la protena en estado nativo o


desnaturalizado dependiendo la finalidad de la purificacin:
Para evaluar la actividad biolgica se requiere en
estado nativo
Para determinar su estructura primaria, puede

Las protenas se pueden purificar para


diferentes finalidades:
Investigacin
Estudiar su funcin biolgica.
Evaluar la estructura primaria, secundaria,
terciaria y cuaternaria de las protenas.
Hacer anlisis filogenticos.
Analizar la relacin estructura-funcin.
Biotecnologa
Aplicaciones mdicas.
Aplicaciones teraputicas.
Suplementos alimenticios
Detergentes y limpiadores.
Cosmticos

Pasos para purificar una protena


Para que purificar la protena:
Actividad
Concentrarla
Purificarla
Propiedades de la protena:
Masa Molecular
Punto Isoelctrico
Solubilidad
Estabilidad
De donde vamos a obtener la
protena:
Localizacin subcelular
Tejido
Organismo
Que tcnica vamos a usar para
purificar. (Dependiendo de que
queremos analizar)
Cuidados de la muestra
durante la purificacin.

Para purificar la mayor cantidad de protena se requiere tomar en


cuenta varios aspectos como:
El tejido del cual vamos a obtener la protena.
La eleccin debe tener en cuenta tres aspectos importantes:
1. Disponibilidad. Cantidad de tejido necesario para obtener
suficiente protena.
2. Cantidad de protena. Cuanta protena de inters encontramos
en el tejido que vamos a analizar.
3. Caractersticas de la protena. Que nos ayuden en el proceso
de purificacin.

Para obtener un mayor rendimiento se necesita:


Rendimiento

Pureza

Desnaturalizacin

Por lo que
Degradacin

Propiedades de la protena
Masa Molecular: Conocer el tamao de la protena es importante cuando
hacemos un gel SDS-PAGE o mtodos cromatogrficos para purificar la
protena como filtracin en gel.
Punto Isoelctrico: Es una valor importante que nos permite seleccionar
adecuadamente el buffer a utilizar o tcnicas como precipitacin
isoelctrica o cromatografa de intercambio inico.
Solubilidad: Diversos factores afectan la solubilidad de las protenas,
tales como la composicin de aminocidos, la estructura tridimensional y
factores externos como pH, temperatura, fuerza inica
Estabilidad: Las caractersticas fsicas y qumicas de la protena son
importantes para la purificacin, en trminos de agregacin, actividad,
etc.
Polaridad: La hidrofobicidad de la protena nos permite seleccionar
tcnicas de purificacin como columnas de interaccin hidrofbicas o en
aspectos de extraccin de protenas.
Uniones especficas: Algunas protenas tienen unin a ligandos que
permiten usar tcnicas de purificacin como la cromatografa de
afinidad.

Tcnicas de purificacin segn las propiedades


de las protenas:
Solubilidad:
Precipitacin.
Carga inica:
Cromatografa de intercambio inico.
Tamao Molecular:
Electroforesis en gel.
Centrifugacin diferencial.
Dilisis.
Cromatografa de filtracin en gel.
Polaridad:
Cromatografa de interaccin hidrofbica.
Uniones especficas:
Cromatografa de afinidad.

Mtodos generales para obtencin de protenas


1. Ruptura del material
2. Obtencin del material libre de clulas (extracto proteico)
3. Precipitacin (sales, pH, alta temperatura, solventes
orgnicos)
4. Concentracin (dilisis o ultracentrifugacin)
5. Fraccionamiento cromatogrfico.

1. Ruptura del material.


. Lisis celular. Consiste en suspender las clulas en una solucin
hipotnica. Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de
la clula, causando hinchamiento y ruptura.
. Destruccin mecnica.

Homogenizacin: hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn


de vidrio que ajustan casi totalmente.

Mortero: moler en un mortero usando arena o almina.


Molino con piedras de vidrio.
Prensa de French: hacer pasar las clulas a gran velocidad a travs
de un pequeo orificio.
Sonicacin: Someter las clulas a vibraciones ultrasnicas.

. Congelacin y descongelacin. La rotura se produce al someter las


clulas a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a
-196C (usando nitrgeno lquido) y pasndolos rpidamente a
temperatura ambiente (25C).

Buffer de lisis
Para evitar o minimizar estos factores la manipulacin de las protenas
durante el proceso de purificacin suele llevarse a cabo en disoluciones
tamponadas, a bajas temperaturas (4C) y se procura que el proceso sea lo
ms corto posible.

2. Obtencin de material libre de clulas (extracto


proteico)
El resultado de los tratamientos de lisado u homogenizado
contiene una mezcla de enzimas membranas y clulas rotas.
Esta mezcla se somete a centrifugacin para eliminar los restos
celulares y separar el sobrenadante, que contiene las protenas
solubles.
El extracto soluble con o sin detergente constituye el extracto
crudo donde se encuentra la protena de inters.

A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que


la centrfuga sea refrigerada, balancear los tubos y
asegurarse siempre que los rotores estn fijos.

3. Precipitacin
Debido a los grupos cargados de las protenas, la solubilidad se
altera aumentando o disminuyendo cuando se modifican factores
como el pH, temperatura y fuerza inica.
Los mtodos de precipitacin son:
Precipitacin con solventes orgnicos.
Precipitacin isoelctrica
Precipitacin trmica
Precipitacin salina

La precipitacin salina de las protenas es una tcnica donde se


precipita una fraccin de protenas mediante el aumento de la
fuerza inica del medio.
Grandes cantidades de una sal agregada a una solucin de
protenas, disminuye la interaccin protena-H2O porque quita la
capa de solvatacin, predominando la interaccin protena-protena
y generando la precipitacin de las mismas.

La concentracin salina a la que se produce la precipitacin no es


igual para todas las protenas, lo que permite usar sta propiedad
para la separacin y purificacin de protenas particulares a partir
de mezclas complejas.
Sin embargo el mtodo ms utilizado es la precipitacin por
salado con (NH4)2 SO4

Precipitacin con sulfato de amonio


El sulfato de amonio (NH4)2SO4 presenta una gran solubilidad (760
g de sulfato de amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20C)
y es un in divalente que alcanza altas fuerzas inicas.
La adicin gradual de sta sal permite el fraccionamiento de una
mezcla de protenas, las cuales son precipitadas pero no
desnaturalizadas.

Salting in. Es elfenmeno por el cual la concentracin de sal


aumenta la solubilidad de la protena. Al aumentar la
concentraciones se reducen las fuerzas electrostticas.
Cuando a un sistema proteico se le adicionan sales neutras en
concentraciones menores a 1.0 M, las protenas incrementan su
solubilidad.
Los cationes y aniones reaccionan con los grupos ionizables de
las protenas impidiendo las interacciones entre las cadenas
laterales oextremos terminales cargados de las protenas.
Salting out. A medida que se aumentan las concentraciones de
sales en el medio, las interacciones protena-protena se hacen
ms fuertes que las interacciones de la protena con el medio
(agua), por lo que precipitan
A concentraciones mayores a 1.0 M, las protenas tienden a
precipitar.

3. Concentracin de protenas
La concentracin es proceso mediante el cual reducimos el
volumen del solvente en el que se encuentra la protena y as
aumentar la cantidad de protena por volumen.
La concentracin de las protenas puede llevarse a cabo mediante
dos tcnicas principalmente:
Dilisis
Ultracentrifugacin

Dilisis
Tcnica que consiste en separar de una mezcla los
componentes de una disolucin, ya sea para eliminar
impurezas como sales o molculas pequeas a travs de
una membrana.

Ultracentrifugacin
Concentracin de una muestra mediante centrifugacin.

Centrifugacin diferencial
Es una tcnica en la cual se aplica la fuerza centrifuga para
separar partculas. Esta basado en el coeficiente de
sedimentacin.

Prctica:
Purificacin de la enzima Lactato
Deshidrogenasa (LDH) de msculo esqueltico
de pollo.

La lactato deshidrogenasa (LDH):


Su funcin es oxidacin de lactato a piruvato

Es una enzima que se encuentra en casi todos los tejidos.


(Hgado, corazn, vasos sanguneos, riones, bazo, pncreas,
pulmones, cerebro y msculo)

Esta formada por 4 subunidades.


Se conocen tres tipos de subunidades: H (LDHB), M
(LDHA) y X (LDHC), que presentan pequeas diferencias en
su secuencia de aminocidos.

Su coenzima es la vitamina B.

Sus subunidades tipo H y M pueden asociarse de manera


que puede formar 5 isoenzimas.
Las diferentes isoenzimas pueden encontrarse en diferentes
tejidos :
LDH-1
LDH-2
LDH-3
LDH-4
LDH-5

(H4): Corazn, msculo, eritrocitos.


(H3M): Sistema retculo endotelial, leucocitos.
(H2M2): Pulmones.
(HM3): Riones, placenta y pncreas.
(M4): Hgado y msculo esqueltico.

Investigar:
Propiedades de la lactato deshidrogenasa de pollo (lactate
deshydrogenase from Gallus gallus isoformas A o B):
Localizacin subcelular
Secuencia primaria de aminocidos
pI (punto isoelctrico)
Nmero de residuos cargados positivamente y negativamente
Actividad enzimtica
Peso molecular
Estructura terciaria y/o cuaternaria
Ligas:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
http://www.uniprot.org/uniprot/P00340
http://www.expasy.org
http://www.uniprot.org/
http://www.brenda-enzymes.info/
Para determinar pI y nmero de residuos de
aminocidoscargados
http://web .expasy.org/compute pi/

Parte A. Extraccin.
1. Cortar en trozos pequeos 80g de pechuga de pollo (eliminar la
grasa y tejido conectivo)
2. Agregar 3 volmenes de amortiguador A fro por cada gramo de
tejido y licuar en pulsos de 3 seg./3 a 6 veces.
3. Filtrar la mezcla con gasa. Se obtiene la fraccin F0.
4. Distribuir el filtrado en botellas de centrifuga y centrifugar a 7,000
RPM a 4C durante 10 min. Recuperar el sobrenadante (F1). Almacenar
1mL a -20C.
Parte B. Precipitacin con sulfato de amonio (NH4)2SO4.
5. Tomar 25 mL de la fraccin 1 y colocarlos en un vaso de precipitado.
6. Agitar en hielo el sobrenadante de manera continua y suave. Agregar
el sulfato de amonio slido (8.5 g), Agitar vigorosamente.
7. Saturacin del 55% de sulfato de amonio.
8. Centrifugar la mezcla turbia a 10,000 RPM a 4C durante 10 minutos.
9. Recolectar el sobrenadante (Fraccin 2) y registrar el volumen. Tomar
una alcuota de 1 mL y almacenar a -20C.
10. Realizar una segunda precipitacin con(NH 4)2SO4 al 75% de
saturacin. Repetir paso 6 y 7.
11. Repetir paso 8.
12. Resuspender el pellet en 1 mL de agua.
13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fraccin 3.

Formula para calcular concentracin de sulfato de amonio

Concentracin inicial de sulfato de amonio (%)

Concentracin final de sulfato de amonio (%)

Gramos de sulfato de amonio que hay que aadir a 1 L de solucin

zar esta tabla para realizar los clculos en la prctica