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Cromatografa HPLC

Cromatografa lquida de alta


resolucin
En sta, un lquido (fase mvil) circula en ntimo
contacto con un slido u otro lquido inmiscible (fase
estacionaria); al introducir una mezcla de substancias
(analitos) en la corriente de fase mvil, cada analito
avanzar a lo largo del sistema con una velocidad
diferente que depender de su afinidad por cada una de
las fases. Esto supone que despus de terminado el
recorrido de la muestra por la columna, cada una de las
substancias introducidas en el sistema eluir con un
tiempo diferente, es decir, estarn separadas.

Principales mecanismos de
interaccin en cromatografa
lquida:
Adsorcin superficial
Particin
Intercambio inico
Exclusin molecular

Cromatografa de absorcin
La fase estacionaria es slida. La separacin se logra
por las diferencias de solubilidad (fase mvil) y de
retencin por adsorcin (fase estacionaria) de la mezcla
de solutos.

Cromatografa de adsorcin
Slica(90%) y almina (10%) son las fases estacionarias ms
comunes.
Tanto las molculas de solutos como de disolventes son
atradas hacia los lugares activos polares de la fase
estacionaria.
Unos solutos sern ms atrados que otros por la fase
estacionaria y as se lograr su migracin diferencial.
Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder de
elucin y la selectividad adecuadas. Normalmente un
disolvente apolar (n-hexano) unido a otro ms activo
(acetona, cloruro de metilo, etc.).

Cromatografa de particin
La separacin se basa en el reparto o distribucin de los
solutos entre una fase mvil lquida y otra estacionaria
inmiscible, soportada sobre un slido inerte. La
discriminacin se produce por diferencias de
solubilidad.

Cromatografa de particin
El mecanismo de actuacin es similar al de un modelo
de extraccin en contracorriente.
Las especies ms retenidas sern las que presenten
mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que
por la fase mvil (eluyente).
La separacin de los solutos se basa en las diferencias
en esta solubilidad relativa.

Cromatografa de particin
Existen dos modos bsicos de operacin:
Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria
polar y fase mvil no polar.
Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria
no polar y fase mvil polar.
Inicialmente tuvo ms auge la fase normal pero en la
actualidad son ms comunes los mtodos
cromatogrficos en fase reversa dada la naturaleza
hidroflica de las muestras de mayor inters (clnico,
contaminacin, alimentos).

Cromatografa de particin
Segn empleemos fase directa o fase reversa se nos va
a alterar el orden de elucin de bandas y el tiempo de
anlisis.

Cromatografa de particin
Materiales comerciales empleados como soportes en
cromatografa de adsorcin y particin.

Cromatografa de adsorcin y
particin.
Principales fases estacionarias en HPLC

Cromatografa de intercambio inico


Tanto fase estacionaria como fase mvil son de
naturaleza inica. La iones de la fase estacionaria son
de carga opuesta a los del eluyente.

Cromatografa de intercambio inico


Se emplea para el anlisis de todo tipo de iones
(inorgnicos y orgnicos).
Las molculas intercambiadoras se ligan a soportes
especficos.
El material intercambiador de la fase estacionaria es de
dimetro de partcula pequeo (1-10 m) y estructura
microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy
baja respecto al material intercambiador convencional
(10-2 10-3 meq/g).

Cromatografa de intercambio inico


Separacin de aniones inorgnicos por cromatografa de
intercambio inico.

Cromatografa de exclusin
molecular.
La separacin se basa en el tamao molecular. Como
fase estacionaria se emplean sustancias de tamao de
poro determinado. Tambin se denomina cromatografa
de permeabilidad por gel (GPC).

Cromatografa de exclusin
molecular.
Como fase estacionaria se emplea un material poroso
inerte (gel) que permite la discriminacin entre los
solutos segn su tamao.
Los analitos de mayor tamao no pueden penetrar en
los poros de la fase estacionaria y son excluidos,
viajando con la fase mvil en el frente de la misma.
Se muestra especialmente til para determinar el rango
molecular de polmeros, protenas, etc.