Purificacin

de Alta Resolucin
Separacin y Procesos
Biotecnolgicos

Caldo de Fermentacin
Con Clulas
Clulas

Sin Clulas

Clulas inmovilizadas
Clulas retenidas

Separacin de Clulas

Rompimiento Clulas
Separacin Material
Intracelular (Desechos)

Sobrenadante

Precipitacin cidos
Nucleicos, Proteasas
Tratamiento de cuerpos
incluidos

Concentracin

Captura
Purificacin Alta
Resolucin

Refinamiento

Intermedia
Pulimento

Pulimento
Intermedia
Captura

Purificacin de Protenas
Cromatografa (Industrial)
No ADsorcin
ADsorcin
Electroforesis (Laboratorio)
Cromatografa
ADsorcin:
Fenmeno de superficie
reversible donde un Soluto (Protena) se
concentra en la superficie de un Slido
(Matriz)
por
accin
de
fuerzas
intermoleculares entre el soluto y el slido
ABsorcin es un proceso fsico o qumico
en el cual tomos, molculas o iones pasan
de una primera fase a otra incorporndose
al volumen de la segunda fase. Esta
segunda fase puede ser lquida, gaseosa o
slida.

ADSORCION
Forma de Operacin:
1.-Batch

Adsorbente

Solucin

ADSORCION
2.-Continua
a) Tanque Agitado en forma continua
b) Lecho fijo (Columnas, ms comn, inventado por Mikhail
Semyonovich Tsvet en 1901 )
c) Lecho Expandido (Nuevo)

a) Tanque Agitado
en forma continua

c) Lecho expandido

Forma de Operacin de las columnas

Carrusel

Tipos de adsorcin

Tipos de Operaciones Cromatogrficas utilizadas en la Purificacin de

Protenas
Tipo de
Cromatografa

Propiedad Fisicoqumica o
Bioqumica

Caractersticas

NO ADSORCION
Filtracin por Geles (GF)
o Exclusin por Tamao

Peso Molecular

Resolucin: Moderada
Capacidad: Baja
Velocidad: Baja

ADSORCION
Afinidad (AC)

Afinidad Biolgica

Resolucin: Excelente
Capacidad: Alta
Velocidad: Alta

Intercambio Inico (IEC)

(Aninico Catinico)

Carga a diferentes pH

Resolucin: Alta
Capacidad: Alta
Velocidad: Alta

Cromatofocusing

Punto Isoelctrico

Resolucin: Muy Alta

Capacidad: Muy Alta
Velocidad: Alta

Interaccin Hidrofbica
(HIC)

Hidrofobicidad Superficial

Resolucin: Alta
Capacidad: Alta
Velocidad: Alta

Fase Reversa (RPC)

Interacciones hidrofbicas e
hidroflicas

Resolucin: Excelente
Capacidad: Intermedia
Velocidad : Alta

Caractersticas bsicas de cada tcnica cromatogrfica

 Cuando se aplican estas tcnica ?

 Cuando se aplican estas tcnica ?

Cuantificacin del proceso de purificacin

Procesos de Adsorcin

Pasos de un proceso de Adsorcin

Paso 1 Acondicionamiento de la matriz,
que se logra ajustando el pH o la fuerza
inica.
Paso 2 Aplicacin y adsorcin de la
muestra, la cual se adsorbe en la fase
estacionaria.
Paso 3 Lavar la columna para que salgan
todas las protenas que no han sido
retenidas.

Paso 4 Modificacin de las condiciones

de la fase mvil de tal manera de
debilitar las interacciones entre la
protena y la fase estacionarias, lo que
provoca la elucin de la protena de
acuerdo a los diferentes grados de
interaccin con la fase estacionaria.
Paso 5 Regeneracin
estacionaria.

de

la

fase

Proceso de Adsorcin
Isotermas de Adsorcin

En la fase slida, q [gr/cm3]

Concentracin de soluto

Las isotermas de adsorcin muestran las caractersticas en el estado de

equilibrio entre la concentracin de soluto en la fase slida (q) y la fase
lquida (y)

Diferentes tipos de Isotermas

Tipo de
Isoterma

Concentracin
de Soluto
adsorbido

Comentarios

Lineal

q= KL y

Es la menos comn y se aplica a bajas

concentraciones de protena
Es la que ms se aplica

Freundlich

q= KF yn

Si n<1 Se tiene una adsorcin favorable

Si n>1 se tiene una adsorcin desfavorable
Tiene fundamentos tericos

Langmuir

q=(qo y)
(K +y)

qo es la concentracin mxima que puede

ser adsorbida por el slido.
Es la nica que posee
tericos.

fundamentos

Isoterma de Langmuir
La isoterma de Langmuir representa el esto de equilibrio del soluto
entre la fase lquida y la slida. Para ello considera una especie de
reaccin qumica entre el soluto y los sitios activos del adsorbente.
Absorcin

S + Y S-P
Donde
Desorcin
S: sitios activos vacantes en el adsorbente
S-P: sitios activos ocupados en el adsorbente
ST: Sitios activos totales
Y: Soluto en solucin

La constante de desorcin, K ,es:

[Y ][ S ]
K
[ S P]

Los sitios totales, ST se pueden expresar como:

[ST] = [S] + [S-P]
Luego, los sitios vacantes se pueden despejar en funcin de los sitios
totales y los ocupados.
[S] = [ST] - [S-P]

De all que se puede re-escribir la constante de desorcin:

[Y ] ([ ST ] [ S P])
K
[ S P]

Despejando los sitios ocupados:

[ ST ][Y ]
[S P]
K `[Y ]

Si se considera que los sitios ocupados son proporcionales a la

concentracin soluto adsorbido:
[S-P] =cte* q
Si los sitios totales, son proporcionales a la concentracin de
soluto mximo a ser adsorbido, q0
[ST] = cte* q0
Se tiene la ecuacin de la isoterma de Langmuir

qo y
q
Ky
Donde
y: concentracin de soluto en solucin
q: Concentracin de soluto en la fase slida

Problema 1

Una enzima quitinasa puede ser adsorbida en celulosa.

La adsorcin sigue una isoterma de Langmuir. La mxima

cantidad de enzima que puede ser adsorbida es de 70 mg/ cm 3 de
celulosa. Cuando la concentracin de quitinasa en solucin es de 50
mg/lt la cantidad de protena adsorbida en la matriz es la mitad de la
cantidad mxima que se puede adsorber
Determine la ecuacin de la isoterma que rige este proceso de
adsorcin.

qo y
70 y
q

K y 0, 05 y

qo y
70 y

K y 50 y

Y en mg/cm3, q en mg/cm3
Y en mg/lt, q en mg/cm3

Adsorcin en Batch
Consiste en dejar que el soluto sea adsorbido en el adsorbente hasta que se
llegue al equilibrio.
La cantidad de soluto adsorbido depender de la cantidad de adsorbente, la
cantidad de solucin y la concentracin inicial de soluto en la solucin y en el
adsorbente.

Donde
yA, y2 Concentracin de soluto en la solucin al inicio y al final de la adsorcin
qA, q2 Concentracin de soluto en la fase slida al inicio y al final de la adsorcin
F: Volumen de solucin

Diseo de un proceso de Adsorcin

Depende del tipo de equilibrio

(Suponiendo un tipo Freudlich)
Lnea de Equilibrio

Condicin Final

q= K yn
Balance de Masa de Soluto
Masa Inicial = Masa Final
F yA + qA S = y2 F + q2 S

Condicin Inicial

Lnea de Operacin
q2 = qA + (F / S) * (yA- y2 )
Donde
yA, y2 Concentracin de soluto en la solucin al inicio y al final de la adsorcin
qA, q2 Concentracin de soluto en la fase slida al inicio y al final de la adsorcin
F: Volumen de solucin

S: Volumen de adsorbente

Problema 2

Una enzima quitinasa puede ser adsorbida en celulosa.

La adsorcin sigue una isoterma de Langmuir. La mxima cantidad de
enzima que puede ser adsorbida es de 70 mg/ cm 3 de celulosa. Cuando la
concentracin de quitinasa en solucin es de 50 mg/lt la cantidad de protena
adsorbida en la matriz es la mitad de la cantidad mxima que se puede
adsorber.
Si se tiene 1.5 litros de solucin con una concentracin de 220 mg/l
de protena y se requiere adsorber el 90% de ella, determine la volumen de
celulosa que se necesita.
Se podra adsorber el 100% de la protena?

Problema 3

Se tiene que la adsorcin de una gentimicina en carbn activado est

descrita por una isoterma:
q = 35.1 y 0.41

donde
q en [mg/cm3], y [mg/ml]

Se planea adicionar 10 cm3 de carbn no utilizado a 3.0 litros de un caldo de

fermentacin que tiene una concentracin de antibitico de 46 [mg/litro]
Qu porcentaje se puede esperar que se adsorba?

Las ecuaciones a considerar son:

q = 35,1 * y 0,45

donde q [mg/cm3] e y [mg/ml]

L
3
q qo y0 y 0 (46 y ) 13.8 0.3 y
S
10
Resolviendo
q= 13.8 [mg/cm3]
y=0.105 [mg/lt]

Luego % de recuperacin = (46-0.105)/46=99.8%

PROCESO ALTAMENTE FAVORABLE