Malaria.

Ciclo

biolgico de la malaria

Diferentes
Mtodos

especies de Plasmodium

de diagnstico.

Cultivos.
sensibilidad

a medicamentos.

Diagnstico

en el mosquito.

Ciclo de vida de Plasmodium sp.

Especies de Plasmodium

Los anillos maduros son

gruesos y grandes.
Los GR se agrandan, y tienen
grnulos de Shuffner.

Los anillos son finos, algunos

marginales, varios en un GR (no se
deforman),
algunos
con
2
cromatinas, gametocitos aparecen
4ta semana.
Los GR presentan puntos de

Especies de Plasmodium

P. malariae:Las formas de anillo

tienen aspecto algo cuadrado, las
formas banda son caracterstica
de esta especie, esquizontes
maduros forma de margarita (10
merozoites). La cromatina esta en
la parte interna del anillo.

P. ovale: en frica tropical.

GR se agranda y T forma de
cometa, los anillos son grandes y
gruesos, si hay grnulos de
Shuffner son
grandes. Los
esquizontes maduros son grandes
y grueso.

Diagnostico: Toma de la
muestra

vdeo

Mtodos de Diagnostico:
Frotis y Gota gruesa
Usar lminas con borde esmerilado.
Realizar una buena puncin digital para
evitar doble puncin. Una vez ejecutada
la gota gruesa (1.5 cm2) es necesario
fijar el frotis con metanol pero al mismo
tiempo se debe cuidar de no fijar la
gota. La gota debe deshemoglobinisarce
con agua destilada.
Preparar la solucin trabajo de Giemsa
(1/10) al momento de efectuar la
coloracin y colorear las lminas.

Lectura en el frotis
El

porcentaje de parasitemia:

% parasitemia = (# GR parasitados/ total de GR) X 100

Si

la parasitemia es elevada (> 10%) examinar 500 GR.

Si la parasitemia es baja (< 1%) examinara 2000 GR.
Contar estadios asexuales y gametocitos por separado,
(gametocitos pueden persisten despus de TX)
Otro mtodo es: + : 1-10 trofozoitos/100 campos
++: 11-100 trofozoitos/100 campos
+++: 1-10 trofozoitos/campos
++++ : > 10 trofozoitos/campos

Lectura de la Gota Gruesa

Contar el nmero de parsitos asexuados (usando un
contador manual) contra 200 leucocitos, La densidad
parasitaria por microlitro se calcular usando la siguiente
frmula:
Densidad parasitaria /l = nmero de parsitos contados x 6000 (o 8,000)
nmero de leucocitos contados

Si se han contado >500 parsitos sin haber llegado a los

200 leucocitos, se calcula la densidad parasitaria. Si el
conteo de parsitos es >10 parsitos x 200 leucocitos, se
continuar el conteo hasta llegar a los 500 leucocitos. Se
examinar 300 campos antes de considerar que una gota
gruesa es negativa. Los gametocitos no sern contados.

CONTROL DE CALIDAD
Se debe tener en cuenta 1:
Valorar la preparacin del material, toma de
muestra, coloracin y microscopa.
Prueba de eficiencia, donde se emplea un
cuejo de lminas con diagnstico conocido.
La calificacin ser segn escala:
Excelente: 95-100% correctos
Bien:
85-94% correctos
Regular: 70-84% correctos.
Mal: menos de 70% correctos.

Mtodos alternativos de Diagnostico:

Deteccin de Antgenos

Dipstick: Se detecta la Ptna. rica en histidina-2 (HRP2) (Shiff et al.2), que es secretada por los eritrocitos con
P. falciparum.
Especificidad = 100%, sensibilidad = 94%; valor
predictivo positivo 100%, VPN 97%.
Dio negativo para pacientes con P. vivax3.
ICT Malaria P.f. (ICT Diagnostics, Sydney, Australia),
tambin detecta solo P. falciparum.
OptiMAL detecta tanto P.vivax y P. falciparum
Estas pruebas estn siendo evaluadas por WHO.

Deteccin de Anticuerpos
Se

usa florescencia
indirecta de
anticuerpos (IFA).
Puede ser usado en:
Screening en
donadores, donde la
parasitemia es baja.
En pacientes con
sntomas o que
recibi TX con lmina
negativa

IFA Positivo a Ag. de

esquizonte de P. malariae

Hay reacciones cruzadas

con Babesia7.

Deteccin de Plasmodium spp.

usando colorantes fluorescentes
La

tcnica Kawamoto: un frotis es coloreado

con naranja de acridina y al ser examinado
con un microscopio de fluorescencia el DNA se
tie de color Verde y el citoplasma RNA rojo.

QBC

(Quantitative Buffy Coat) Becton

Dickinson: la sangre es colectada en un capilar
con anticuagulante que tiene naranja de
acridina, centrifuga, y los capialres se
examinan en un microscopio de fluorescencia.

Diagnstico: Pruebas moleculares

De

A: Gel de agarosa
S: Pb estndar (50pb
ladder)
1: P. vivax (120 pb)
2: P. malarie (144 pb)
3: P. falciparum(205 pb)
4: P. ovale (800 pb)

200 L de sangre se extrae el DNA

genmico (QIAamp blood kit).
Se realiza un Nested-PCR (primer de
Smounou et.al6): - PCR1: 1 L de DNA es
amplificado con primers especficos para el
gnero. - PCR2: 1 L del producto de PCR1
y se amplifca con primers especficos para la
especie.
10 L del PCR2 es separado por
electroforesis con 2% de de agarosa
Coloreado por 15 min con Bromuro de Etdio
y visualizado en transiluminador de UV.

Cultivos
Para el cultivo in vitro se han propuesto dos tcnicas:
1.- Un cultivo de maduracin de corta duracin:
Donde se obtiene generaciones sucesivas de parsitos.
Esto facilitan los estudios bioqumicos, inmunolgicos y
quimioterpicos.
2.- Cultivos de multiplicacin (intenta reemplazar al
husped natural). Su objetivo consiste en mantener in
vitro una fase especfica del desarrollo (por ejemplo
formas exoeritrocticas o formas eritrocticas a sexuadas).
Lo ideal sera poder obtener varias generaciones
sucesivas pero han tenido poco xito.

Cultivos de formas
eritrocticas
Los

estudios en los parsitos aviares en cultivo sobre

las necesidades nutricionales (v.g., de cido
pantotnico,
de
coenzima
A
y
de
ciertos
aminocidosde) han aportado muchos datos, siendo
estos estudios confirmados en los parsitos que
infectan a los mamferos, obteniendose informaciones
suplementarias sobre las necesidades de lpidos, de
cido p-aminobenzoico y de otros aminocidos.
En fecha reciente se ha demostrado la posibilidad de
cultivar parsitos del paludismo aviar en tejidos
embrionarios, tanto in vivo como en explantes.

Cultivo continuo para P.

falciparum
P. falciparum fue cultivado a 38C en
RPMI1640, con suero humano tipo A,
7% de CO2, 1-5% de O2, se agrega
cada 3a 4 das eritrocitos humanos, y
48 horas se completa su ciclo asexual.

Cultivo P. falciparum
Informes

recientes sobre el cultivo de P. falciparum

indican que el parsito completa su ciclo de desarrollo
asexuado intraeritroctico durante el perodo de cultivo y
que al cabo de 48 horas los merozoitos penetran en
nuevos hemates; sin embargo, el factor de
multiplicacin del parsito es slo de 1,5 a 1,4. La nueva
tcnica de perfusin parece permitir una multiplicacin
de funcin 2, pero an as el ndice de proliferacin
resulta relativamente bajo. A pesar de sus
imperfecciones, el cultivo in vitro a permitido emprender
estudios sistemticos en varios centros y se ha utilizado
con xito para explorar la sensibilidad de las cepas
parasitarias a distintos medicamentos antipaldicos.

Cultivo: Aislamiento de
Ookinetos
Para el aislamiento de Ookinetos de eritrocitos
no
infectados se usa dos mtodos:
1. Cojines de Nycodenz

11

Se liza los eritrocitos con 0.34M NH4 Cl y es y se

vierte en un cojn con 17% Nycodenz a 20C
girar
30a 1660g, los Ookinetos se obtienen en la
interfase
se lavan y se cuentan.

2. Aislamiento de Ookinetos:
Usando un magneto para
retener a los ookinetos12
La columna se lava con 2.5
mL Medio de Scheneider
antes de pasar la muestra y
luego se pasa la muestra con
una jeringa lentamente y los
ookinetos son seprados por
un campo magnetico y de
reciben en 1mL de medio
para ookinetos,

Sensibilidad a
medicamentos.

En

la actualidad, el P. falciparum es resistente

a la cloroquina (CQ) y la sulfadoxinapirimetamina (SP) en casi toda la regin
amaznica y a la CQ en la Costa del Pacifico de
Sudamrica. Adems, en los ltimos aos,
varios investigadores han reportado infecciones
de P. vivax con falla teraputica a la CQ. El Per
y Bolivia han terminado sus estudios basales y
han hecho cambios en sus tratamientos de
primera lnea para infecciones no-complicadas
de P. falciparum.
Plasmodium se han aislado dos genes MDR: el
gen pfmdr1 y el gen pfmdr2. El primero ha sido
implicado a la resistencia a drogas CQ y la
mefloquina.