MARCADORES

MOLECULARES.
Katherine Zuñiga Morales.
Ingrid Carolina Quintero.
Leidy Angarita Bautista.
Hingrid Yurley Bautista.
Edson Eduardo Ortega.
 CONTENIDO.
Marcador Genéticos: Descripción
Marcadores Moleculares
1. Tecnologías basadas en ADN:
 RFLP

2. Tecnologías basadas en PCR:

 AFLP
 Microsatélites, SCAR, CAPS,
ISSR
 RAPD, DAF, AP-PCR
 EST, matrices, DArT, SNP
 Marcadores
Geneticos:
Descripcion.
Los marcadores genéticos identifican en
un individuo las características del
fenotipo, del genotipo o de ambos.

El seguimiento de la herencia de los

marcadores puede realizarse de
generación en generación.
 Marcadores
Geneticos:
Tipos:
1. Marcadores morfológicos.

2. Marcadores proteicos (o
bioquímicos).
3. Marcadores de ADN (o
moleculares).
 1. Marcadores
Morfologicos.
1. Ventajas:
Fácilmente disponibles.
Su evaluación requiere, generalmente, de
equipo sencillo.
Constituyen la medida más directa del
fenotipo.

2. Desventajas:
Requieren un conocimiento práctico del
cultivo o de la especie vegetal (o de
ambos).
Están sujetos a influencias ambientales.
Su número es limitado.
 2. Marcadores
Proteicos
(o bioquimicos).
Se basan en las propiedades de migración de las
proteínas, las cuales permiten separarlas
mediante electroforesis.

Se detectan mediante ensayos histoquímicos

específicos.
1. Ventajas:
Requieren de un equipo de
laboratorio relativamente sencillo.
Son un valioso complemento de la
evaluación morfológica.
2. Desventajas:
Están sujetos a influencias
ambientales.
Su número es limitado
 2. Marcadores
de ADN
(o moleculares).
Funcionan como señaladores de diferentes
regiones del genoma.

Son ampliamente utilizados en genética

humana, vegetal, animal y microbiana.
Son polimorfismos detectados en la secuencia
del ADN del núcleo o de los organelos.
1. Ventajas:
Su número es, potencialmente,
ilimitado.
No están sujetos a influencias
ambientales.
Son una medida objetiva de la
variación.
 Desventaja
Polimorfismo del
Son
ADN.
Diversos sucesos pueden causar
variantes, más o menos complejas, en la
secuencia de nucleótidos del ADN. Tales
variantes se conocen como polimorfismos.

El polimorfismo se manifiesta en diferencias

del genotipo lo que se demuestra en los
diversos perfiles de bandas que se detectan
con un procedimiento apropiado y quizás del
fenotipo.

Varios sucesos pueden producir

polimorfismos:
1. Mutaciones puntuales
2. Inserciones o deleciones.
 1. Mutaciones
puntuales.
Las mutaciones puntuales ocurren cuando
una base de la secuencia del ADN es
reemplazada por otra.
La longitud de la secuencia del ADN no
cambia.
AGTTAGCTGACTGATTTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC

REEMPLAZO

AGTTAGCTGACTAGCCTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC
 2. Inserciones o
delecciones.
Son el resultado de la adición o la desaparición de
varias bases en la secuencia del ADN. La longitud
de la molécula cambia.

AGTTAGCTGACTGATTTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC

DELECCIÓN

AGTTAGCTGACTTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC

AGTTAGCTGACTGATTTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC

INSERCIÓN AGCAT

AGTTAGCTGACT GATTTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC
 3. Rearreglos.
Los reordenamientos cromosómicos ocurren
como resultado de la recombinación genética o
de la inserción de elementos transponibles.

La longitud de la molécula puede cambiar o

quedar igual.
Marcadores

Moleculare
s.
 Marcadores
Moleculares.
1. Tecnologias basadas en ADN:
 Polimorfismo de longitud de fragmentos
de restricción (RFLP).

3. Tecnologias basadas en
PCR:
1. Polimorfismo de longitud de fragmentos
amplificados (AFLP).
2. Sitios de secuencia etiquetada
(Microsatélites, SCAR, CAPS, ISSR).
3. PCR con cebadores arbitrarios (RAPD,
DAF, AP-PCR).
4. Últimas estrategias (EST, matrices, DArT,
SNP).
 1.
Polimorfism
o
De Longitud
De
1. Polimorfismo de
longitud de
fragmentos de
restriccion (RFLP).
La detección del RFLP se basa en la posibilidad
de comparar patrones de bandas generados
mediante la digestión con enzimas de restricción
del ADN patrón.
Las etapas de laboratorio son:
1. Aislamiento del ADN.
2. Digestión y electroforesis.
3. Transferencia del ADN por el método
Southern.
4. Hibridación del ADN.
a. Procedimiento
b. Sonda de ADN
 (1) Aislamiento
de ADN.
1. Se extrae ADN total de las células (de la
planta).

3. Alternativamente, puede usarse el ADN

cloroplástico y el mitocondrial.
5. El ADN debe estar limpio y debe tener
elevado peso molecular.

Complicaciones:
 Rotura durante el aislamiento.
 ADN degradado por las nucleasas.
 Polisacáridos aislados junto con el ADN.
 Aislamiento de metabolitos secundarios.
(2) Digestion de
Restriccion y
Electroforesis.
1.

-
2.
4. +

Es necesaria la hibridación para

detectar fragmentos específicos

3.
(3) Transferencia
del ADN X el
Metodo Southern.
PESO

MEMBRANA
GEL
(4) Hibridacion del
ADN: a. El
Procedimiento. 1. ADN adherido a
la membrana

2. Hibridado
con la sonda

5.Película
4.Sonda expuesta a
hibrídada los Rayos X

3. Se descarta
el sobrante
de sonda
 Hibridacion del
ADN:
b. La Sonda. 1. ADN total o
ADNc
8.Los clones
recombinant
2.ADN digerido es se
seleccionan
3.Selección de y siguen
fragmentos creciendo
de ADN según
su tamaño
- 7. Los clones
se dejan
crecer en
+ una placa
Fragmento de
ADN patrón

4. Vector
extraído de 6.
bacterias y
5.El fragmento El vector recombinante se
abierto de ADN se introduce en las bacterias y se
inserta al clona
vector
 Hibridacion del
ADN:
c. Fuentes de
sondas.
ADN nuclear:
 Genotecas genómicas
 ADNc

ADN citoplasmático
Genotecas de ADN mitocondrial y
cloroplástico.
 La especificidad de muchas sondas de copia
única requiere que se construyan genotecas
cuando se estudian nuevas especies.
 Sin embargo, a menudo pueden usarse
sondas de géneros emparentados.
Hibridacion del
ADN:
Fuentes de
sondas.
Secuencias repetitivas o de tipo minisatélite:
 Repetición básica de 10 a 60 pb en tándem.
 Altamente variables entre individuos del
género humano.
 Polimorfismos en el número de unidades
repetidas (también llamados VNTR).

En las plantas, para detectar secuencias

minisatélite se han usado sondas
provenientes de una repetición interna del
gen de la proteína III del bacteriófago M13.
 Equipo (RFLP).
Recursos:
 Agua destilada o desionizada (o ambas).
 Reactivos.

Equipo:
 Refrigerador y  Medidor de pH.
congelador.
 Balanza estándar.
 Campana extractora de
flujo laminar.
 Unidades de
 Centrífuga. electroforesis.
 Fuente de energía  Cuarto oscuro.
eléctrica.  Transiluminador
 Hornillo o microondas.
 Imagenes
1. RFLP.
2.

3. 4.
 Imagenes
5. RFLP.
6.

7. 8.
 Imagenes
9. RFLP.
10
.

11 12
. .
 Imagenes
9.
RFLP.
10
.

11 12
. .
 RFLP en
imagenes:
Resumen. SITIO DE
RESTRICCIÓN

A
SONDA
DIGESTION

B
MUTACION = Un nuevo
sitio de restricción
A B
TRANSFERENCIA

ELECTROFORESIS HIBRIDACION
 Interpretacion
de las Bandas
RFLP (1).
Una mutación crea un nuevo sitio de restricción
dentro de la región de interés. Por consiguiente,
se detectan dos bandas más pequeñas en la
película. Nuevo sitio de
restricción
SITIO DE
RESTRICCIÓN

A A B

B
SONDA
 Interpretacion
de las Bandas
RFLP (2).
Una mutación crea un nuevo sitio de restricción
entre sitios de restricción contiguos, creando un
fragmento de restricción más corto.
Nuevo sitio de
restricción
SITIO DE
RESTRICCIÓN

A A B

B
SONDA
 Interpretacion
de las Bandas
RFLP (3).
Una inserción de una secuencia de ADN entre
sitios de restricción contiguos crea un fragmento
de restricción más largo.
SITIO DE Insercción
RESTRICCIÓN ocurrida

A A B

B
SONDA
 Interpretacion
de las Bandas
RFLP (4).
Una deleción de una secuencia de ADN entre
sitios de restricción contiguos crea un
fragmento de restricción más corto.
SITIO DE Delección
RESTRICCIÓN ocurrida

A A B

B
SONDA
 Interpretacion
de las Bandas
RFLP (5).
Uno de los sitios de restricción adyacentes
cambia o se pierde a causa de una mutación o
una delección.
En consecuencia,
SITIO DE
el fragmento de restricción se
altera. RESTRICCIÓN Sitio
perdido

A A B

B
SONDA
Ventajas De los
RFLP.
Metodología sumamente sólida y muy
transferible entre laboratorios.
No se requiere información acerca de la
secuencia del ADN.

Muy recomendables para el análisis

filogenético de especies emparentadas
porque se basan en la homología de las
secuencias.

Adecuado para construir mapas de

ligamiento genético.

Marcadores específicos del locus que

Desventajas de
los RFLP.
Requieren cantidades grandes de ADN.

No permiten la automatización.
Bajos niveles de polimorfismo en algunas
especies.

Pocos loci detectados por ensayo.

Necesitan disponer de una genoteca de
sondas apropiadas.

Lentos, especialmente con sondas de copia

única.
Costosos.
 Ejemplos de
Aplicaciones
RFLP..
Diversidad genética.
Relaciones genéticas.
Historia de la domesticación.
Origen y evolución de las especies.
Deriva genética y selección.
Cartografía de genomas y de tipo
comparativo.
Localización de genes.
Descubrimiento de genes valiosos de
especies silvestres.
Construcción de genotecas exóticas.
ecnologias Basada
En PCR:
 1. (AFLP).
Polimorfismo de
Longitud de
Fragmentos
Amplificados.
 Polimorfismo de
longitud
de fragmentos
amplificados
(AFLP).
Caracteristicas
principales:
 Es una combinación de las tecnologías de
RFLP y de PCR.

 Está basada en la amplificación selectiva de

los fragmentos de restricción mediante la
PCR.

 Es un método muy sensible para caracterizar

el ADN cualquiera que sea su origen y su
complejidad.
 Cuatro
Etapas.
1. El ADN es digerido con dos enzimas de
restricción diferentes.

3. Adaptadores oligonucleótidos se ligan a los

extremos de los fragmentos de ADN.

5. Se amplifican subconjuntos específicos de

los productos de digestión del ADN
empleando combinaciones de cebadores
selectivos.

7. Se detecta el polimorfismo empleando

radioisótopos, colorantes fluorescentes o
tinción de plata.
 Digestion Del
ADN y Ligacion.
Una de las enzimas de restricción hace
cortes frecuentes,
(su sitio de reconocimiento es de cuatro
bases, por ejemplo MseI).

El segundo enzima de restricción hace

cortes infrecuentes,
(su sitio de reconocimiento es de seis
bases, por ejemplo EcoRI).

Se ligan a los fragmentos de ADN

generados adaptadores sintéticos de doble
cadena, que son específicos de cada sitio
de restricción.
Reacciones de la
PCR y Su
Deteccion.
Se realiza una primera PCR (preselectiva), usando
cebadores oligonucleótidos complementarios al
adaptador y a los sitios de restricción. Se añade
un nucleótido a los cebadores para seleccionar
sólo un subconjunto de fragmentos.

Los productos de la amplificación preselectiva se

someten a otra PCR, y nuevamente se selecciona
un subconjunto de fragmentos. Generalmente, en
la segunda amplificación selectiva se agregan dos
nucleótidos más a los cebadores.

La separación de los fragmentos de la reacción se

realiza mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida de tipo desnaturalizante (geles de
secuenciación) o electroforesis capilar.
 AFLP imagenes:
Resumen.
ADN genómico

Digestión con dos enzimas de

restricción

Empalme de los adaptadores

Pre-Amplificación:
Cebadores = adaptadores + 1 base

Amplificación selectiva:
Cebadores = adaptadores + 1 base + 2 bases

Perfil de AFPL
 Equipo Del AFLP.
Recursos:
 Agua destilada o desionizada (o
ambas).
 Reactivos.

Equipo:
 Refrigerador y  Balanza estándar.
congelador.  Unidades de
 Centrífuga. electroforesis vertical.
 Termociclador.  Transiluminador
 Hornillo o microondas. ultravioleta.
 Medidor de pH.  Secuenciador
 Campana extractora de automático.
flujo laminar.  Fuente de energía
Interpretacion De
las Bandas de
La
AFLP.
técnica AFLP detecta polimorfismos
generados por cambios (de presencia o tamaño)
en los sitios de restricción o en los adyacentes a
éstos.
 Distintas combinaciones de nucleótidos
preselectivos y selectivos aumentarán la
probabilidad de encontrar polimorfismos
útiles.
 A mayor número de bases selectivas,
menor detección de polimorfismo.
 Las bandas se registran, generalmente,
como presentes o ausentes.
 En función del espesor de la banda, se
pueden detectar bandas heterocigóticas y
homocigóticas, aunque no siempre los
resultados son confiables.
 Gel de AFLP
Procesado
Con Cebadores
Fluorescentes.
 AFLP -
Detectados Con
Tincion de Plata.
Ventajas de los
AFLP.
AFLP permiten una exploración rápida de los
polimorfismos del genoma entero.
Puesto que se genera un gran número de
bandas, cada marcador da una huella
identificadora de ADN sumamente
informativa.
Son también altamente reproducibles.

No se necesita información previa de las

secuencias ni hay que generar sondas de
hibridación.

Es una técnica muy útil para crear mapas

genéticos en forma rápida.

Permiten la generación de “perfiles de

Desventajas de
los AFLP.
AFLP generan cantidades enormes de
información, por lo que pueden requerir un
análisis automatizado y, por consiguiente,
tecnología de computación adecuada.

Son de tipo dominante.

En los mapas genéticos, los AFLP se agrupan,

con frecuencia, en los centrómeros y
telómeros.

Requieren bastante técnica en el laboratorio

y, especialmente, en el análisis de los datos.
Ejemplos de
Aplicaciones.
Evaluación de diversidad genética.

Análisis de distancia genética.

Huella identificadora de ADN.

Análisis de colecciones de
germoplasma.

Construcción de mapas genéticos.

Seguimiento de marcadores de
diagnóstico.
 2. (Sts).
Sitios De
Secuencia
Etiquetada.
 Sitios De
Secuencia
Etiquetada (Sts).
A diferencia de las técnicas basadas en
cebadores arbitrarios, los STS dependen de
un cierto conocimiento de las secuencias.

Los marcadores basados en STS son

codominantes.
Tienden a ser más reproducibles porque se
usan secuencias cebadoras más largas.
Requieren, básicamente, los mismos
protocolos de laboratorio y el mismo equipo
que la PCR estándar.

a. Microsatélites (SSR, STMS o SSRP).

b. SCAR.
 a.
Microsatelites
(SSR, STMS o
SSRP).
Los microsatélites son secuencias cortas (1-
10 pb) que se repiten en serie.

Para poder usarlos como marcadores, debe

identificarse, en primer lugar, su ubicación
en el genoma de interés.

Los polimorfismos en la región repetida se

pueden detectar mediante una PCR con
cebadores diseñados a partir de la región del
ADN adyacente a la repetición.
 Identificacion
De Regiones
Microsatelite.
SECUENCIA DISPONIBLE NO HAY SECUENCIA DISPONIBLE EN
EN LA BASE DE DATOS. LA BASE DE DATOS.

USAR MICROSATELITES USAR SECUENCIAS DE

CONOCIDOS PARA AISLAR MICROSATELITE COMO
1. CLONES CANDIDATOS DE
1. SONDA FRENTE AL ADN
IDENTIFICAR LAS UNA GENOTECA. DIGERIDO.
SECUENCIAS QUE
1. CONTIENEN
MICROSATELITES. 2. SECUENCIAR LOS CLONES
POSITIVOS. 2. DETECTAR EL
POLIMORFISMO.

DISEÑAR CEBADORES
2. ESPECÍFICOS. 3. DISEÑAR CEBADORES
ESPECÍFICOS.

DETECTAR EL
DETECTAR EL
3. POLIMORFISMO. 4. POLIMORFISMO.
 Estructura.
Región
repetida
Regiones adyacentes únicas

El número de repeticiones es altamente variable

entre individuos
 Seleccion De Los
Cebadores.
Diseñar cebadores complementarios ( ) de
las regiones adyacentes
 Metodologia y
Visualizacion.
Metodología:
 Extracción del ADN.
 PCR con cebadores específicos de las
regiones adyacentes al microsatélite.
 Separación de fragmentos.

Visualización:
 Mediante electroforesis en geles de
agarosa, usando tinción con bromuro de
etidio y luz ultravioleta.
 En geles de acrilamida, tiñendo con nitrato
de plata, o empleando radioisótopos.
 Con secuenciadores automáticos,
empleando cebadores pre-marcados con
fluorescencia.
Tincion Con
Bromuro De
Etidio.
Tincion Con
Nitrato De
Plata.
 Equipo
Microsatelites
(SSR, STMS o
SSRP).
Recursos:
 Agua destilada o desionizada (o ambas).
 Reactivos.

Equipo:
 Refrigerador y  Medidor de pH.
congelador.  Balanza estándar.
 Campana extractora  Unidades de
de flujo laminar. electroforesis vertical y
 Centrífuga. horizontal.
 Termociclador.  Transiluminador
 Hornillo o ultravioleta.
microondas.  Secuenciador
 Ventajas y
Desventajas.
Ventajas:
 Requieren muy poco ADN y éste no
necesariamente de alta calidad.
 Sumamente polimórficos.
 Uniformemente distribuidos en todo el
genoma.
 Interpretación sencilla de los resultados.
 Automatizados fácilmente, y permiten la
carga simultánea de productos en el mismo
carril.
 Buena resolución analítica y alta
reproducibilidad.

Desventajas:
 Procedimiento de descubrimiento
 Ejemplos De
Aplicaciones De
Los SSR..
Genotipificación de individuos.

Evaluación de germoplasma.

Diversidad genética.

Cartografía de genomas.

Estudios filogenéticos.

Estudios evolutivos.
 b. Region
Amplificada
Caracterizada
Por Una
Secuencia
(SCAR).
Los SCAR aprovechan una banda que ha sido
generada en un experimento de RAPD.

Usan cebadores de16 a 24 pb, diseñados a

partir de los extremos de marcadores RAPD
clonados.

Esta técnica transforma una banda propensa a

dificultades de interpretación o de
reproducibilidad en un marcador muy
confiable.
 Pasos Para La
Obtencion De
Polimorfismos De
SCAR..
Se identifica, en un gel de RAPD, una
banda que despierta un interés potencial.

La banda se corta y se retira del gel.

El fragmento de ADN se clona en un
vector y se obtiene su secuencia.
Se diseñan cebadores específicos (16 a 24
pb de longitud) para ese fragmento de
ADN.

La reamplificación del ADN patrón con los

nuevos cebadores presentará un patrón
de PCR nuevo y más sencillo.
 Diagrama Del
Procedimiento
Xra Obtener Los
SCAR.. 1 2 3
Gel de RAPD

Clonar la banda
Banda polimórfica polimórfica en un
vector

Después de la
amplificación con los
nuevos cebadores, el
resultado es un patrón de
bandas más fácil de
interpretar
Secuenciar el
fragmento y diseñar
nuevos cebadores para
amplificar únicamente
la banda de interés
1 2 3

Banda polimórfica
 Ventajas y
Desventajas.
Ventajas:
 Patrones más sencillos que los RAPD.

 Ensayo sólido gracias al uso de

cebadores largos específicos.
 Herencia mendeliana. A veces
convertibles a marcadores
codominantes.

Desventajas:
 Requieren un conocimiento mínimo de
las secuencias.
 Requieren esfuerzo y gastos para
diseñar cebadores específicos de cada
locus.
 c. Secuencia de
Restriccion
Amplificada y
Polimorfica (CAPS).
Este método se basa en el diseño de
cebadores específicos, en la amplificación
de fragmentos de ADN, y en la generación
de fragmentos más pequeños, posiblemente
variables, mediante un enzima de
restricción.

El objetivo de esta técnica es convertir una

banda amplificada, que no muestra
variación, en una banda polimórfica.
 Pasos Que
Requiere la
Generacion De
CAPS.
Se reconoce la importancia de una banda, de un
fragmento de ADN, de una secuencia génica o de
otro tipo de marcador.
O bien la banda se detecta a través de la PCR (y
se corta del gel y el fragmento se clona y es
secuenciado) o la secuencia del fragmento está
ya disponible.
Se diseñan cebadores específicos partiendo de la
secuencia del fragmento.
Los cebadores recién diseñados se usan para
amplificar el ADN patrón.
El producto de la PCR se somete a digestión con
varios enzimas de restricción.
Se identifica el polimorfismo empleando alguno
de los enzimas.
Generacion De
CAPS.
A/A B/B A/B
R R R R R R R R

PCR + digestión con el enzima R +

electroforesis.

*
 Ventajas y
Desventajas.
Ventajas:
 Ensayo sólido, porque se usan
cebadores específicos largos.
 Marcadores co-dominantes.
 Favorecido por marcadores que pueden
estar ya localizados en un mapa
genético.
 Identifican polimorfismos en
marcadores que anteriormente no eran
informativos.

Desventajas:
 Requieren, al menos, un mínimo nivel
de conocimiento de las secuencias.
 El diseño de cebadores específicos para
 d. Secuencia
Entre
Repeticiones
Simples (ISSR).
Son las regiones situadas entre
microsatélites.

La técnica se basa en la amplificación,

mediante la PCR, de las secuencias
ubicadas entre microsatélites.

Gracias a la conocida abundancia de

secuencias repetitivas esparcidas por
todo el genoma, identifica múltiples loci.
 Identificacion De
Polimorfismos
ISSR..
Se ejecuta una PCR típica en la cual los
cebadores han sido diseñados partiendo de
una secuencia repetitiva de microsatélite y se
han extendido, en una o varias bases, en la
secuencia adyacente a modo de puntos de
anclaje. Puede haber varias opciones:
 Se emplea sólo un cebador.
 Se emplean dos cebadores de características
similares.
 Se combinan un cebador de secuencia de
microsatélite anclado y un cebador aleatorio
(como los usados para RAPD).
 Diseno de
Cebadores Para
Polimorfismos
ISSR..
NNNN(CA)n
(CA)nNNNN REPETICION CA
ADN GENOMICO
NNNNNNNNNNNCACACACACACACACACACACA NNNNNNNNNNNNTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT NNNNNNNNNNNNCACACACACACACACACACACACACACACANNNNNNNNNNNNN

REPETICION CA
(CA)nNN NN(CA)n

Producto de la PCR cebador

anclado en 3’

Producto de la PCR cebador

anclado en 5’
 Ventajas y
Ventajas:
desventajas.
 No requieren información previa sobre
secuencias.
 Se puede encontrar variación dentro de regiones
únicas del genoma en varios loci
simultáneamente.
 Tienden a identificar niveles significativos de
variación
 Específicos de secuencias de microsatélites.
 Muy útiles para realizar perfiles de ADN,
especialmente de especies estrechamente
relacionadas.
Desventajas:
 Marcadores dominantes.
 Puede ser necesaria la electroforesis en gel de
3. PCR con
Cebadores
Arbitrarios.
 3. PCR con
Cebadores
Arbitrarios.
MAAP (caracterización con ‘amplicones’
múltiples arbitrarios) es la sigla propuesta
para incluir las tres tecnologías principales
que corresponden a esta categoría:

1. Polimorfismo de ADN amplificado al azar

(RAPD).
2. Amplificación de la huella de ADN (DAF).
3. Reacción en cadena de la polimerasa
iniciada al azar (AP-PCR).
 RAPD.
Características principales:
 Emplea un cebador aleatorio corto
(generalmente, de 10 bases).
 Amplifica trozos anónimos de ADN.

Etapas de laboratorio:
1. Aislamiento del ADN.
3. PCR con un cebador.
5. Separación de los fragmentos de ADN
mediante electroforesis.
7. Visualización de los fragmentos de
ADN con bromuro de etidio.
 Deteccion De
Productos RAPD.
Electroforesis de geles de agarosa o de
acrilamida y visualización con bromuro de
etidio.
 Diagrama de
Resumen.
A D
BANDA
AMPLIFICADA

E B
G CEBADOR

C F
MOLECULA DE
ADN

GEL E GEL E
C C
A A
D D
B B
F F
 Equipo RAPD.
Recursos:
 Agua destilada o desionizada (o ambas).
 Reactivos.

Equipo.
 Refrigerador y  Balanza estándar.
congelador.  Unidades de
 Campana extractora electroforesis vertical
de flujo laminar. y horizontal.
 Centrífuga.  Transiluminador
 Termociclador. ultravioleta.
 Hornillo o  Secuenciador
microondas. automático.
 Medidor de pH.  Fuente de energía
Interpretacion De
Patrones de
Bandas RAPD (1).
El polimorfismo del ADN en un grupo de
individuos puede deberse a:

 Ensamblaje frustrado en el sitio del

cebador
 Aparición de un nuevo sitio de
reconocimiento del cebador
 Longitud de la región amplificada entre
los sitios de reconocimiento del cebador
 Interpretacion
De Patrones de
Bandas RAPD (2).
A causa de la naturaleza de los marcadores
RAPD, sólo puede evaluarse la presencia o la
ausencia de una banda. Los criterios para
seleccionar bandas que califican son:

 Reproducibilidad: es necesario obtener los

mismos resultados en experimentos
repetidos.
 Espesor (de la banda).
 Tamaño.
 Observación de la segregación esperada en
una población segregante.
Interpretacion de
patrones de
bandas RAPD:
Ejemplo de un gel
RAPD de mala
calidad.
Interpretacion de
patrones
de bandas RAPD:
Ejemplo de un gel
RAPD de buena
calidad.
Ventajas de los
RAPDs.
Número alto de fragmentos.

Técnica sencilla.

Los cebadores arbitrarios se

adquieren fácilmente, y no requieren
de información inicial de tipo genético
o genómico.

Se requieren cantidades diminutas del

ADN patrón.

Los costos unitarios por ensayo son

bajos.
Desventajas de
los RAPDs.
De herencia dominante.

Falta de conocimiento previo de la

identidad de los productos de la
amplificación.

Problemas de reproducibilidad.

Problemas por co-migración.

 Ejemplos de
Aplicaciones.
Diversidad genética.
Caracterización de germoplasma.
Estructura genética de poblaciones.
Domesticación.
Detección de variación somaclonal.
Identificación de cultivares.
Pureza híbrida.
Cartografía genética.
Diferencias Entre
las Tecnologias
DAF y RAPD.
Respecto a la DAF:

 Las concentraciones de cebador son más

altas
Se usan cebadores más cortos (de 5 a 8
nucleótidos).

 Un ciclo de dos temperaturas en lugar de

un ciclo de 3 temperaturas (usado en
RAPD).

 Obtención de combinaciones de bandas

sumamente complejas.
Diferencias Entre
las Tecnologias
AP-PCR y RAPD.
Respecto a AP-PCR:
 La amplificación se realiza en tres partes,
cada una con sus propios requisitos y
concentración de elementos constitutivos.
 Se emplean concentraciones altas del
cebador en los primeros ciclos de la PCR.
 Se eligen arbitrariamente cebadores de
longitud variable y diseñados, a veces,
para otros fines (por ejemplo, el cebador
universal de análisis de secuencias M13).
 En Resumen.
La tecnología RAPD se basa en una PCR
sencilla con un solo cebador arbitrario y corto.

La técnica RAPD produce fácilmente un

número notable de bandas, pero sus
marcadores son dominantes y son frecuentes
los problemas de reproducibilidad.

DAF y AP-PCR son tecnologías alternas

respecto a los RAPD, pero más complejas.
 Ultimas
Estrategias.
1. Marcador de secuencia expresada
(EST).

3. Tecnología de matrices.

5. Tecnología de matrices de diversidad

(DArT).

7. Polimorfismo de un solo nucleótido

(SNP).
 1. Marcador de
Secuencia
Expresada (EST).
Las etiquetas de secuencia expresada son
pedazos pequeños de secuencia del ADN
que tienen, generalmente, de 200 a 500
nucleótidos de largo.

Se generan al secuenciar bien sea uno o

ambos extremos de un gen expresado
proveniente de una genoteca de ADNc.

Esta estrategia es una forma sumamente

eficaz de encontrar genes nuevos.
 Diseno De
Cebadores
De EST. } ARNm
A C U G
Transcriptasa inversa

} ARN
A C U G

T G A C
} ADNc

Degradación del ARN por ribonucleasas

Síntesis de la segunda cadena del ADN

}
A C T G
ADN de doble cadena
T G A C

Cebador Cebador
5´EST 3´EST
 Los EST:
Ventajas y
Desventajas.
Ventajas:
 Muy buenos como marcadores
genéticos.
 Codominantes.
 Las secuencias se pueden generar
rápidamente.
 Fuente eficiente de secuencias para
obtener cebadores para SSR.

Desventajas:
 El aislamiento del ARNm puede ser
complicado.
 Los intrones, que pueden contener
 Los EST:
Ejemplos De
Aplicaciones.
Las aplicaciones de los EST se basan en el
hecho de que se originan a partir de
segmentos de secuencias génicas:

2. Comparación de la diversidad génica en

diferentes organismos.
3. Estudios de evolución génica.
4. Búsqueda de supuestos ortólogos en
bases de datos.
5. Sondas para estudios de expresión
génica
6. Detección de SNP*.
 2. Tecnologia de
Matrices o
Arreglos.
 Las matrices son ordenamientos de pequeños
fragmentos de ADN fijados a portaobjetos de
vidrio o membranas de nylon.
 Esta tecnología permite hacer el seguimiento
simultáneo del genoma entero.
 El principio fundamental de las matrices es el
apareamiento de las bases .o la hibridación.
de sondas cortas con secuencias
complementarias de ADN.
 Las matrices se construyen con ADNc
(matrices de ADNc), con secuencias
genómicas o con oligonucleótidos
sintetizados in silico (“arreglos de ADN”).
 Matrices:
Ventajas y
Desventajas.
Ventajas:
 Tecnología de alto rendimiento.
 Exploración del genoma entero.
 Permite el descubrimiento de la relación
genotipo-fenotipo.

Desventajas:
 Debe estar disponible la información
sobre la secuencia de los genes.
 Costosa.
 La cantidad y el tipo de los datos
producidos requiere de un alto nivel de
experiencia en computación y de un
equipo avanzado.
 Matrices:
Ejemplos de
Aplicaciones.
Identificación de secuencias (génicas o de
mutación génica).

Determinación del nivel de expresión de los

genes.
Ensayo de la abundancia de secuencias
específicas en el ADN genómico.
Análisis de la expresión de gran número de
genes (matrices de ADNc) Identificación de gran
número de marcadores específicos de ADN, (por
ejemplo, polimorfismo de un solo nucleótido o
SNP), mediante hibridación molecular (matrices
de oligonucleótidos sintéticos).
3. Tecnologia De
Matrices de
Diversidad
(DArT).
Comprende dos pasos:

1. Generación de la matriz

3. Genotipificación de la muestra
 DArT: (1)
Preparacion De
La Matriz.
Se clonan los fragmentos generados por
restricción, que representan la diversidad de
un acervo genético. Al resultado se le llama
una 'representación' (de 0.1% a 10% del
genoma, comúnmente).

Se identifican los clones polimórficos de la

genoteca obteniendo primero la matriz de
fragmentos tomados de un conjunto aleatorio
de clones e hibridando luego la matriz con
diferentes muestras.

Los fragmentos de los clones polimórficos se

inmovilizan en una matriz.
 DArT: (2)
Preparacion De
Gx GyLa Matriz.
Gn
ADN de interés

Mezcla de Utilizar método de reducción de

genomas. complejidad, por ejemplo, digestión
con enzimas de restricción,
ligamiento de adaptadores,
amplificación por PCR.

Clonar fragmentos de Genoteca Seleccionar clones

la representación. individuales y
amplificar por PCR.

Productos de la PCR
purificados y ordenados.
DArT: (1) Obtencion
del Genotipo De Una
Muestra.
Marcar la representación (ADN) de la muestra
con fluorescencia e hibridarla con la matriz.

Examinar la matriz y medir, para cada

fragmento de la matriz, la cantidad de señal
de hibridación.

Empleando marcas múltiples, contrastar la

representación de una muestra con la
representación obtenida de otra o con una
sonda testigo.
 DArT: (2)
Obtencion del
Genotipo De Una
muestra.
Gx Gy
Seleccionar 2 genomas para el análisis

Utilizar el mismo método de

reducción de la complejidad que
usó para hacer el panel de
diversidad

Marcar cada subgrupo genómico:

color rojo... Marcar cada subgrupo
genómico: color verde...

Hibridar con la matriz

 DArT: Ventajas
y Desventajas.
Ventajas:
 No requiere información sobre las secuencias y
Alto rendimiento.
 Adquisición rápida de datos y análisis rápido.
 Detecta cambios de una sola base así como
inserciones o deleciones.
 Detecta diferencias en la metilación del ADN,
según el enzima usado para generar los
fragmentos.
 Genera clones listos para secuenciar.
 Requiere muestras pequeñas de ADN.
 Buena transferencia de marcadores entre
poblaciones de mejoramiento y Puede
automatizarse totalmente.
Desventajas:
 Los marcadores son dominantes.
 Tiene requisitos técnicos considerables.
DArT: Ejemplos
de Aplicaciones.
Caracterización rápida del
germoplasma.

Construcción de mapas genéticos.

Mejoramiento asistido por

marcadores.
4. Polimorfismo
De Un Solo
Nucleotido
(SNP).
Sustituciones de una sola base entre
secuencias homólogas.

Los SNP se dan con mayor frecuencia que

cualquier otro tipo de polimorfismo.

Pueden identificarse mediante matrices y el

equipo DHPLC.
(1) Interpretacion
De
Los SNP.
GTCATAGCATTATTATTATTATTACAGGACTA
CAGTATCGTAATAATAATAATAAGTCCTGAT

1bp 15 30

GTCATAGCATTATTATTATTATTACAGGACTA
CAGTATCGTAATAATAATAATAAGTCCTGAT
(2) Interpretacion
De
Los SNP.

SNP #1
SNP #2