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Programa de Ps-Graduao em
Farmacologia
Introduo
Pythium insidiosum o oomiceto aqutico
causador
da
pitiose,
uma
doena
piogranulomatosa que acomete animais e
humanos.
Fonte: EMBRAPA
Introduo
Brasil
Tailndia
Reviso bibliogrfica
Pythium insidiosum
Reino Straminipila
Classe Oomycetes
Ordem Pythiales
Famlia Pythiaceae
Gnero Pythium
Reviso bibliogrfica
Caractersticas de P. insidiosum:
Crescimento micelial;
Produo de zosporos;
Ausncia de ergosterol;
Presena de celulose e -glucanas.
Gaastra et al.,
Reviso bibliogrfica
Desenvolvimento do
miclio
Formao
Zoosporngi
o
e Zosporos
Zosporos
livres
Ciclo
30C a 40C
Normal
Zosporos
em guas
Germinam
Fixam-se
nas plantas
da gua
paradas
Zosporos
atrados
por pelos
dos equinos
Fixam-se numa
ferida e
germinam
Crescimento
vegetativo
nos tecidos
(PITIOSE)
Reviso bibliogrfica
Espcies acometidas:
Reviso bibliogrfica
Diagnstico:
Cultivo de
materiais
biolgicos
Tcnicas
imunolgic
as
Tcnicas
molecular
es
Reviso bibliogrfica
Tratamento:
Singularidades do agente
Dificuldade do tratamento
Geralmente necessrio utilizar associaes
Objetivo Geral
Analisar as caractersticas filogenticas e
filogeogrficas de isolados brasileiros e
tailandeses de P. insidiosum, bem como
caracterizar a susceptibilidade de P. insidiosum
frente a compostos metlicos.
Objetivos especficos
Utilizar o gene Exo-1,3--Glucanase (exo1) para a caracterizao
molecular de isolados de P. insidiosum oriundos de diferentes regies do
Brasil;
Caracterizar filogeneticamente os isolados brasileiros de P. insidiosum;
Comparar geneticamente os isolados brasileiros e tailandeses de P.
insidiosum empregando o marcador exo1;
Investigar o perfil filogeogrfico dos isolados brasileiros e tailandeses de P.
insidiosum;
Avaliar a susceptibilidade dos isolados de P. insidiosum frente aos
compostos metlicos de cobre (Cu), zinco (Zn), cdmio (Cd) e mangans
(Mn);
Detectar o metal com maior atividade antimicrobiana para ser empregado
no desenvolvimento de formulaes eficazes contra P. insidiosum.
Apresentao
O estudo foi conduzido na forma de dois manuscritos:
Manuscrito 1: Phylogenetic and phylogeographic
analysis of P. insidiosum isolates of Brazil and Thailand
based on Exo-1,3--Glucanase gene
Manuscrito 2: In vitro susceptibility of Pythium
insidiosum to metallic compounds containing cadmium,
lead, copper, manganese and zinc
Manuscrito 1
Phylogenetic and phylogeographic
analysis of P. insidiosum isolates of
Brazil and Thailand based on exo1,3--glucanase gene
Artigo a ser submetido Veterinary Microbiology
Tatiana Corra Ribeiro, Carla Weiblen, Maria Isabel de Azevedo, Snia
de Avila Botton, Lizandra Jaqueline Robe, Daniela Isabel Brayer Pereira,
Danieli Urach Monteiro, Douglas Miotto Lorensetti, Janio Morais Santurio
Objetivo
Manuscrito
1
Investigar
as
relaes
filogenticas
e
filogeogrficas entre isolados de P. insidiosum de
diferentes regies do Brasil e da Tailndia, usando
a anlise de sequncias do gene exo-1,3-glucanase (exo1).
Metodologia
Manuscrito
1
Manuscrito
1
Metodologia
Species
Isolate
Source
Geographic origin
Geographic coordinates
Latitude
Longitude
P. insidiosum
118
Equine
Jaguari
S2929'38.5595"
W5442'12.7069"
P. insidiosum
121
Equine
SantaMaria
S2941'14.303"
W5348'55.7168"
P. insidiosum
123
Equine
CachoeiradoSul
S302'0.5352"
W5253'35.8134"
P. insidiosum
138
Equine
Corumb
S190'35.3624"
W5739'17.0806"
P. insidiosum
178
Equine
Corumb
S190'35.3624"
W5739'17.0806"
P. insidiosum
187
Equine
Jari
S2917'33.7945"
W5413'27.2748"
P. insidiosum
210
Equine
Uruguaiana
S2945'42.8836"
W575'9.0341"
P. insidiosum
290
Equine
SantaMaria
S2941'14.303"
W5348'55.7168"
P. insidiosum
291
Equine
Pelotas
S3146'33.7148"
S3146'33.7148"
P. insidiosum
293
Equine
RioGrande
S321'59.5074"
W525'55.0118"
P. insidiosum
296
Equine
Pelotas
S3146'33.7148"
S3146'33.7148"
P. insidiosum
135
Equine
Corumb
S190'35.3624"
W5739'17.0806"
P. insidiosum
219
Equine
SoLourenodoSul
S3121'46.2841"
W5158'43.8845"
P. insidiosum
223
Equine
CachoeiradoSul
S302'0.5352"
W5253'35.8134"
P. insidiosum
143
Equine
Corumb
S190'35.3624"
W5739'17.0806"
P. insidiosum
232
Equine
Uruguaiana
P. insidiosum
ATCC58637
Equine
CostaRica
S2945'42.8836"
-
W575'9.0341"
-
P. insidiosum
CBS119452
Human
Thailand
Manuscrito
1
Metodologia
Species
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
Phytophthora sojae
Phytophthora capsici
Phytophthora
parastica
Phytophthora
infestans
Isolate
Geographic origin
Geographic coordinates
Latitude
Longitude
GenBank accession
number
P1
P2
P3
P6
P7
P9
P10
P11
P15
P16
P17
P19
P20
P22
P24
P25
P27
P28
P29
P30
P32
P40
Pi-S
P6497
CBOT129-H24
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Unknown
Unknown
Bangkok
Lopburi
Chantaburi
Nan
Ayuthaya
Lumpang
NA
Saraburi
Yasothon
Saraburi
Chonburi
NA
NA
Patomthani
Supanburi
Nakornpatom
NA
NA
NA
Rachaburi
NA
Pichit
-
N1343'24.307"
E10028'34.4348"
N152'59.8459"
N1247'52.4231"
N1846'32.2745"
N1421'11.6489"
S621'25.002"
N1431'43"
N1547'33.5076"
N1431'43"
N1321'40"
N141'15.0208"
N1428'28.1611"
N1358'44.0004"
N1331'41.8415"
N1611'13.9268"
-
E10053'25.1156"
E1029'47.7785"
E10046'22.9501"
E10034'8.283"
E10632'37.2336"
E10054'41"
E1048'43.0177"
E10054'41"
E10059'6"
E10031'30.0994"
E1007'3.7661"
E10010'13.1725"
E9948'48.316"
E10020'59.2422"
-
GU994090a
GU994091a
GU994092a
GU994093a
GU994094a
GU994095a
GU994096a
GU994097a
GU994098a
GU994099a
GU994100a
GU994101a
GU994102a
GU994103a
GU994104a
GU994105a
GU994106a
GU994107a
GU994108a
GU994109a
GU994110a
GU994111a
LC033487b
XM_009541535c
BT032091
INRA-310
Unknown
XM_008895332c
Unknown
AF494014d
Source
Metodologia
Manuscrito
1
Anlise filogentica
Metodologia
Manuscrito
1
Anlise filogeogrfica
31 amostras de origem geogrfica conhecida;
Diversidade Nmero de locus polimrficos, nmero
de substituies, heterozigose esperada e Pi
Neutralidade Teste D (Tajima, 1989) e FS (Fu , 1997)
Nvel de diferenciao entre os isolados FST
Anlise espacial de varincia molecular (SAMOVA) e
Anlise de varincia molecular (AMOVA) (Dupanloup et
al., 2002)
Manuscrito
1
Resultados
Clade
1
Clade
2
Clade
3
Figure 1: Phylogenetic relationship among the examined Pythium insidiosum isolates inferred by posterior
probability (PP), maximum likelihood (ML), maximum parsimony (MP), and Neighbor-Joining (NJ) analyses based
on Exo-1,3--Glucanase gene. The numbers along branches indicate bootstrap values and posterior probabilities
Manuscrito
1
Resultados
Tabela 2: Results of diversity analysis
Molecular diversity
indices
No. of polymorfism loci
Mean expected
heterozygosity
s.d. expected
heterozygosity
No. of transitions
No. of transversions
No. of substitutions
No. private subst. Sites
Pi
13
Thailan
d
73
0.04521
0.26352
0.15436
0.15437
0.12721
0.20256
0.16488
0.05328
9
4
13
7
4.159
43
33
76
67
24.244
26
24.042
18.5
20.506
44.5
44.548
37
42.426
14.20148 14.20182
Brazil
Mean
s.d.
43
42.426
No.: number
s.d.: standard
deviation
Pi: Nucleotide
diversity
Resultados
Manuscrito
1
Figure 2: Map of locations sampled for Brazil and Thailand for analysis of genetic
diversity. The symbols represent the structure observed in AMOVA. Saraburi is
identified with a diferent symbol once has isolates in both clade 2 and 3.
Manuscrito
1
Resultados
d.f.
Sum of
squares
Variance
components
Percentage of
variation
Among
groups
588.138
15.75143Va
80.82
Among
populations
within groups
20
107.935
1.00103Vb
5.14
Within
populations
39
106.750
2.73718Vc
14.04
Total
61
802.823
19.48964
Manuscrito
1
Resultados
Table 4: Pairwise FST values for the three populations obtained in the
AMOVA.
Brazil
Thai 1
Thai 2
Thai 1
Thai 2
0.90755*
0.78131*
0
0.75687*
*Significant
values
Manuscrito
1
Resultados
Table 5: Results of neutrality tests (Tajimas D and
Fus Fs).
D de Tajima
Tajima's D
Tajima's D
p-value
Brazil
Thai1
Thai2
Mean
s.d.
0.94007
-0.65032
-1.33207
-0.34744
1.16596
0.875
0.281
0.082
0.41267
0.41257
-10.752
0
0.13087
0.504
1.02585
0.7
-3.19842
0.40133
6.55687
0.36112
FS de Fu
FS
FS p-value
Discusso
Manuscrito
1
Manuscrito
1
Discusso
Gene exo 1
2229pb
742 aminocidos
Domnios BglC e X8
(Keeratijarut et al., 2015)
Discusso
Manuscrito
1
Manuscrito
1
Discusso
derivao
dos
isolados
Concluso
Manuscrito
1
Manuscrito 2
In vitro susceptibility of Pythium
insidiosum to metallic compounds
containing cadmium, lead, copper,
manganese and zinc
Artigo submetido Mycopathologia
Tatiana Corra Ribeiro, Carla Weiblen, Snia de Avila Botton, Daniela
Isabel Brayer Pereira, Francielli Pantella Kunz de Jesus, Camila Marina
Verdi, Leticia Trevisan Gressler, Janio Morais Santurio
Metodologia
Manuscrito
2
Manuscrito
2
Metodologia
C- C+
Manuscrito
2
Resultados
Table6Minimuminhibitoryandfungicidalconcentrationsforleadacetate,zincacetate,zincsulfate,manganese
acetate,cadmiumacetateandcopperacetateagainstPythium insidiosum isolates(n=23).
Time
Metallic
compound
s
Lead
acetate
Zinc
acetate
Zinc
sulfate
Manganes
e
Acetate
Cadmium
acetate
Copper
acetate
48h
MIC
MFC
MIC
MFC
MIC
MFC
MIC
MFC
MIC
MFC
MIC
MFC
MIC or MFC
16
32
64
128
256
>256
Range
(g/mL)
GM3
(mg/liter
)
MIC
504
23(100)
23(100)
>256
>256
>256
>256
>256
-
>256
-
23(100)
23(100)
>256
>256
>256
>256
>256
-
>256
-
23(100)
23(100)
>256
>256
>256
>256
>256
-
>256
-
23(100)
>256
>256
>256
>256
23(100)
>256
>256
2(8.7)
2(8.7)
3(13.1)
1(4.3)
5(21.7)
3(13.1)
7(30.4)
7(30.4)
6(26.1)
7(30.4)
3(13.1)
16-256
16->256
91.88
111.43
128
-
256
-
3(13.1)
7(30.4)
5(21.7)
4(17.4)
4(17.4)
4-64
15.52
64
1(4.3)
5(21.7)
5(21.7)
6(26.1)
1(4.3)
4(17.4)
1(4.3)
4-256
26.71
MIC,minimuminhibitoryconcentration;2 MFC,minimumfungicidalconcentration;3GM,geometricmean;4Minimalconcentrationto
inhibitthegrowthof50%ofisolates;5Minimalconcentrationtoinhibitthegrowthof90%ofisolates.
1
MIC
905
Discusso
Manuscrito
2
Discusso
Manuscrito
2
Discusso
Manuscrito
2
Concluso
Manuscrito
2
CONCLUSO
O emprego do gene exo1 demostrou que este um importante
marcador para o estudo da filogenia e filogeografia de P. insidiosum.
A anlise filogentica e filogeogrfica dos isolados brasileiros e
tailandeses a partir das sequncias parciais do gene exo1 foi capaz
de esclarecer os padres evolutivos deste oomiceto. Os isolados
brasileiros de P. insidiosum so derivados dos isolados tailandeses.
Os isolados tailandeses possuem uma diversidade muito maior que
os isolados brasileiros. Isto comprova a origem mais antiga dos
isolados de P. insidiosum tailandeses em relao aos brasileiros. Os
isolados brasileiros apresentam sinais de estruturao, o que
evidncia a necessidade de maiores estudos nestas populao, uma
vez que fenmenos evolutivos esto ocorrendo.
Este estudo certamente representa um primeiro passo importante
para compreender a epidemiologia e evoluo de P. insidiosum.
CONCLUSO
Isolados de P. insidiosum tiveram seu crescimento
inibido na presena de compostos contendo
cdmio e cobre. Portanto, podemos considerar
esses metais candidatos para o desenvolvimento
de quimioterpicos com grande potencial
teraputico contra a pitiose. Entretanto
necessrio mais estudos para a avaliar sua
toxicidade e eficcia in vivo.
Referncias bibliogrficas
Agradecimentos
LABIOPAR