SISTEMAS DE ELUCIN

MSc. Holger Maldonado Garca

2008

Elucin
Consiste en el transporte de una mezcla de analitos
por una fase mvil a travs de un lecho
estacionario.
Tiempos de retencin
Rpido o corto tiempo, la composicin de la fase
mvil debe ser ajustada para que el analito tenga
ms afinidad por la fase lquida.
Largo tiempo, el analito interacta fuertemente
con la fase estacionaria dentro de la columna.

Elucin
Los sistemas de elucin pueden ser:
Elucin normal o Isocrtica
Elucin por gradiente:
Gradiente de flujo
Gradiente de elucin

Elucin Normal o Isocrtica

Es un sistema de elucin en que la composicin de
la fase mvil es constante en el tiempo
%

t
Composicin de la fase mvil constante

Elucin Isocrtica
La separacin de compuestos puede describirse usando
las ecuaciones siguientes:
Tiempo de retencin (tR)

(1)

tR = to + tok

Ancho de banda (W)

(2)

= Vm(1+k) N1/2

Resolucin (Rs)

(3) Rs = N
4

Factor de capacidad (k)

(4)

-1 1+k

k = (tR to)/to

Sistemas de Gradientes
Para encontrar las mejores condiciones de separacin por
cromatografa lquida deben manejarse:
Modificaciones de todos los equilibrios que afectan las
reacciones.
analito (fase mvil)
analito (fase estacionaria)
Cambios de disolvente normalmente desplazan el
equilibrio, da como resultado mejor separacin pasando de
elucin isocrtica (pasa un nico eluyente) a elucin en
gradiente.

Gradiente de Elucin
Sistema que consiste en cambiar la composicin
de la fase mvil conforme transcurre el anlisis.
Se utilizan de 2 a 4 solventes de diferente
polaridad y se varia el porcentaje de cada solvente
en la fase mvil.
El gradiente se obtiene mezclando 2 o ms
eluyentes diferentes, variando la composicin de
la fase mvil con el tiempo.

Gradiente de Elucin
El gradiente siempre cambia, desde la mezcla de
disolventes en los que peor eluyen los solutos hacia la
composicin en la que mejor eluyen. Esto se hace para
mejorar la resolucin y se acortan los tiempos de elucin
de las especies que se retienen ms fuertemente.
%

t
Composicin de la fase mvil variable

Gradiente de Elucin
Puede ser:
Gradiente de elucin lineal o continuo: el cambio de
capacidades eluyentes se puede hacer por un cambio
constante en la composicin de la fase mvil.
Gradiente de elucin por escalera: el cambio de
capacidades eluyentes se puede hacer por saltos.
El gradiente no necesita ser lineal, puede variar tambin de
manera que el eluyente no cambie linealmente con el
volumen.

Gradiente de Elucin
Propiedades del eluyente que se pueden variar:

Fuerza inica
pH
Capacidad de formar puentes de hidrgeno
Fuerzas de las series eluotrpicas
Constante dielctrica
Concentracin del reactivo que compite por los sitios
activos en la fase estacionaria.
Los disolventes que se van a combinar para preparar un
determinado gradiente deben ser miscibles, es decir que deben
ser solubles mutuamente a cualquier concentracin.

Sistema de Gradientes de Elucin

Considrese el siguiente cromatograma

El flujo empleado es el adecuado, los picos aparecen

uniformemente distribuidos. Sin embargo, los picos 4, 5, 6 y
7 aparecen inaceptablemente resueltos. Utilizar flujos ms
bajos alargara el tiempo de anlisis.

Sistema de Gradientes de
Elucin
Supngase que se cambia la fase mvil, empleando
una que resuelva esos picos.

Pero los picos 1 y 2 pierden resolucin y el 8 queda

excesivamente retenido.

Sistema de Gradientes de
Elucin
La solucin es evidente: por qu no emplear la primera fase
mvil para la elucin excepto en el intervalo en que eluyen
los picos 4, 5, 6 y 7? As se tiene un sistema de gradientes de
elucin.

Diferencias en una separacin utilizando

gradiente lineal o en escalera

Diferencia en una separacin cuando se

cambia la pendiente del gradiente

Gradiente de Flujo
Imagnese un cromatograma a flujo constante F1

El pico nmero 4 aparece mucho ms rtenido que el resto de

los picos y por ello, aparece anormalmente privado de su
agudeza.

Gradiente de Flujo
Si se aumentara el flujo todos los picos eluiran en tiempos
menores.

Pero se observa que se ha perdido resolucin entre los picos

2 y 3 a causa de haber empleado otra velocidad de flujo que,
probablemente, no era la ptima.

Gradiente de Flujo
La solucin ideal sera mantener la elucin de
los 3 primeros picos, 1, 2 y 3, con el primer
flujo, y despus aumentarlo para que eluya no
tan tarde.

Sistema de Gradientes
Al cambiar la composicin de la fase mvil
y por tanto su ionicidad, se estar afectando
la capacidad de retencin de la fase
estacionaria. De modo general puede
aplicarse en cualquier tipo de HPLC:
adsorcin, particin y de intercambio
inico, fundamentalmente. Como y cunto
afecta la presin y la reproducibilidad del
sistema.

Sistema de Gradientes

Sistema de Gradientes

Sistema de Gradientes
En el sistema de dos bombas el gradiente es
aumentado a alta presin tras las bombas, cada una
de ellas bombea su solvente a alta presin, la
composicin del gradiente se controla variando
simultneamente el flujo de ambas bombas para
generar un flujo constante.
En el sistema de una bomba, los solventes se
mezclan previamente a baja presin, a travs de
una cmara de baja presin con su vlvula
proporcional, el gradiente se forma a baja presin.

Sistema de Gradientes
Ambos sistemas se controlan con sus correspondientes
microprocesadores. As se obtiene una gran flexibilidad en
el sistema cromatogrfico. Se pueden hacer gradientes
simples o complejos, con tramos lineales, exponenciales o
mesetas isocrticas.

Sistema de Gradientes
En una separacin de una mezcla ms o menos
compleja, es deseable intentar que los cambios en
los gradientes sean alcanzados lo ms rpido
posible.
Vcmara
t% =
( 1 X/100)
F
t%: tiempo preciso para alcanzar un cambio en la
fase mvil X (en tanto por ciento),
Vcmara: volumen de la cmara de mezcla
F: flujo

Sistema de Gradientes
En los sistemas de dos bombas, los
solventes se mezclan detrs, a alta presin y
el volumen mezclado generalmente es
mayor que en los sistemas de una bomba.
Respecto a la reproducibilidad, segn lo
anterior, los sistemas se dos bombas son
mejores, logrando resultados reproducibles.

Efecto de la Temperatura
La temperatura tiene un efecto importante sobre las
separaciones en cromatografa lquida, porque a altas
temperaturas:

La viscosidad disminuye, originando que la fase mvil

fluya ms fcilmente.
Las velocidades de difusin del soluto aumentan,
originando una difusin ms rpida en todas direcciones.
El equilibrio entre los diversos solutos y la fase
estacionaria se desplaza en proporciones diferentes.
Las velocidades de los equilibrios de intercambio son
generalmente ms rpidas.

Efecto de la Temperatura
En otras palabras, todas las variaciones de
equilibrio y todos los procesos de transporte
cambian con las temperatura.
La figura muestra los efectos de la temperatura en
cromatografa lquida. En el cromatograma se
presentan las diferencias entre la separacin a
20C y 30C para tres grupos de analitos. Como
puede observarse, las separaciones resultan
significativamente influidas por diferencias de
temperatura de 10.