Вы находитесь на странице: 1из 35

Introduo

Leso
da
plasmtica:

membrana

Estresse mecnico

Patgenos- toxinas formadoras


de poros e fosfolipases
Sistema
imuneprotenas
formadoras de poros para eliminar
patgenos e clulas invadidas por
eles

Introduo
Clulas nucleadas- sobrevivncia por
selagem
Falha na selagem- perda do contedo
intracelular
Dano irreversvel- influxo de Ca2+
extracelular

Introduo
Abrupta elevao
do Ca2+
intracelular

Ativao de
proteinases e
fosfolipases

Elevao de Ca2+ intracelular:

Sinal de perigo imediato pela clula lesionada.


Em clulas lesionadas, o influxo de clcio
extracelular engatilha o processo de blebbing na
membrana, o que considerado prenncio de
morte celular.

Dano generalizado
bicamada lipdica
e citoesqueleto

Blebs
Blebs so brotamentos das
clulas
cuja
membrana
plasmtica
se
separou
localmente do crtex de
actina.
Contrao
cortical

da

actomiosina

Presso hidrosttica

Herniaes
plasmtica

da

membrana

Blebbing

Mecanismos Ca2+ dependentes e


Ca2+ independentes
Ativao da miosina ou induo de
um rearranjo do citoesqueleto e
estruturas corticais
Reaes
fisiolgicas
:

Citocinese

Locomoo

Cresciment
o celular

Leso
celular e
apoptose

O papel especifico do blebbing


nos processos fisiolgicos e
patolgicos ainda controverso

Blebbing

Neste estudo: blebbing como um


mecanismo de resistncia aos danos
membrana plasmtica

Armadilha
para
o
segmento
da
membrana lesada e confina seu citosol
Selagem: isolamento do corpo celular
por tampo de anexina A1 (um ligante
de clcio e de protenas de membrana)

Blebbing

Aps leso plasmalemal, a perda de


constituintes intracelulares encontra-se
limitada zona dos blebs.

Os blebs selados - depsito de Ca2+


potencialmente prejudicial, evitando,
assim, que o mesmo desencadeie
protelise e liplise dentro da clula
propriamente dita.

Materiais e Mtodos
Reagentes
Anticorpo monoclonal anti-anexina A1 - BD Biosciences
Fluo-5F AM - Invitrogen AG
Endonucleases de restrio, Taq polimerase e ligase de DNA T4 - New
England Biolabs
peCFP-N1 e peYFP-N1 - Clontech
Plasmdeos de SureSilencing shRNA - Biosciences.
Outros reagentes - Sigma.

Materiais e Mtodos
Cultura celular e transfeces
Clulas HEK
Clulas astrocitomas humanas- U373
Clulas primrias de msculo liso
Clulas T- Jurkat e Clulas B- Raji foram mantidas e
transfectadas
A sequncia de codificao de anexina A1 foi clonada nos
vetores de protena de cores fluorescentes seguida de
amplificao por PCR a partir de cDNA da bexiga de msculo
liso humano. Anexina A1- protena fluorescente amarela e
CFP foram expressos transitoriamente em clulas alvo.

Resultados

Leso da membrana plasmtica desencadeia blebbing.

(a) Clulas renais embrionrias


(a)
Permeabilizao
com
estreptolisina
Otoxina
bacteriana formadora de poros
(b) Formao de blebs- 36%
(b) Contrao da actomiosina
cortical- formao dos blebs
(b)
Clulas
tratadas
com
blebistatina: no responderam
ao estmulo por SLO

Resultados

Leso da membrana plasmtica desencadeia blebbing.

Blebbing induzido por SLO- consequncia direta do influxo de


clcio induzido pelo dano.
(c) Clcio livre na ordem de nanomolar- poucos blebs
(c) Clcio livre na ordem de micromolar- aumento significante, com pico
em 5-10 micromolar
(c) Maior aumento de clcio extracelular- diminuio do blebbing (2,5 mM)
Exacerbada elevao do clcio intracelular em clulas permanentemente
permeabilizadas- dano generalizado a bicamada lipdica e cito esqueleto e
depleo nos nveis intracelulares de ATP

Resultados

Blebbing foi uma resposta celular universal a leso


plasmalemal: todos os tipos de clulas que foram testadas
at agora formaram blebs em resposta a uma leso,
independentemente da natureza do agente de degradao.

Resultados

Blebbing induced by mechanical injury and bacterial PLC

Human astrocytoma

Human embryoncic kidney

Intracellular dynamics of Annexin A1 over time

Irreversible perforation--------- 1) translocation of cytoplasmic A1 to plasma membrane


2) Translocation of nuclear A1 to nuclear envelope
3) Results in leakege of CFP (Cyroplasmic protein)

Blebbing protects cells from membrane damage

Blebbing protects cells from membrane damage

Blebbing protects cells from membrane damage

Blebbing protects cells by isolating damage regions

Localized accumlation
of Ca and translocation
ofAnnexin

Bleb 1 is repaired

Blebbing protects cells by isolating damage regions

Mechanical damage
SCRATCH

Bleb 2 is repaired

Localization of Annexin in blebs also occurs in non-transfected cells

Annexin A1 plugs damaged blebs

Effect of blocking Annexin A1 with either Ab or siRNA

Discusso

Anteriormente, a formao de Blebs em clulas


injuriadas era considerado um prenncio de
morte.
O processo de blebbing de algumas clulas
antevinha sua lise.
Farmacologicamente a induo de blebbing
aumenta a taxa de sobrevivncia da clula.
Representa uma tentativa de escape de
morte e
BlebbingRecupera
no um mecanismo de promoo.
o

Sem
Blebbing
Morte
celular

Discusso

Um papel at o momento desconhecido do


blebbing na proteo da membrana plasmtica
durante a injuria.
Ca2+

Anexina
A1

Contrao
dirigida de
miosina

Injria

Babiychuk et al, 20

Discusso

Injria na membrana plasmtica leva a uma


ruptura da membrana com uma mudana de
permeabilidade
Ruptura mecnica, poros formados por protenas
citotxicas, lise da bicamada lipdica.
Influxo de Ca2+ e efluxo de constituinte
intracelulares.

Discusso

Influxo de Ca2+ desencadeia a fosforilao da Miosina II via


clcio (Cinase de miosina de cadeia leve dependente de
calmodulina)

Contrao do citoesqueleto cortical leva a um aumento da


presso hidrosttica

A regio lesada da membrana gera uma hrnia para


formar o bleb.

Se a clula consegue reparar o dano o Ca2+ bombeado


para fora e o bleb retrai. Se no...

Discusso

Quando a concentrao de Ca2+ atinge 10M, a Anexina


A1 se liga membrana, assim criando um vcuo de
Anexina A1 no bleb.

Anexina citoslica se direciona para o bleb

Pescoo estreito do bleb visto como um hot-spot de Ca2+

Mais clcio mais anexina A1.

Ceramida (induo depende do clcio) promove o aumento


da seletividade de Anexina A1

Formao de plug no pescoo

Evita efluxo do citosol e evita invasores extracelulares.

Discusso

Contudo o blebbing pode ser tambm desencadeado por


um mecanismo independente de Ca2+ via ativao de
caminhos dependentes de ROCK

observado em clulas expostas a subs. Txica ou que


esto entrando em apoptose.

Clulas apoptticas, nas quais a homeostase do clcio


comprometida, sucumbem mais rapidamente a injria.

A habilidade das clulas apoptticas em gerar


espontaneamente blebbing pode ser uma antecipao de
um deficiente potencial de reparo.

Discusso

Essa formao espontnea de blebbing na


superfcie celular protegeria o corpo celular
Uma toxina encontraria primeiro um bleb prexistente.
Assim, prevenindo os passos para a formao de
um novo bleb e otimizando a velocidade de
recuperao do dano.
Evitando ataque e invaso

Discusso
Clulas T e
NK
(Perforina)

Department of
Health

Integridade
da MP
restaurada,
protegendo
contra
necrose

Blebbing
est
intimament
e ligado a
proteo

Keefe et al., 2005

Keefe et al.
(acumula
o de
corante
extracelula
r)

Concluso
No est
relacionado
com o reparo.
Eliminao da
leso

Tentativa de
reparo anterior

Se o dano for
muito extenso,
a regio deve
ser sacrificada

O estudo identificou uma nova


estratgia adotada pelas clulas
para responder injria.
Deficincias nesse mecanismo
pode contribuir para a
patognese de doenas
degenerativas, infecciosas
eimunes.

Aumento [Ca2+ ]
i responsvel
pela morte
celular

Referncias bibliogrficas

BABIYCHUK, Eb et al. Blebbing confers


resistance against cell lysis.Cell Death And
Differentiation,Bern 3012- Switzerland, v. 1,
n. 18, p.80-89, 02 jul. 2010.
http://www.gcarlson.com/index.php, acesso em
04/11/2014 s 22:00h
Keefe D, Shi L, Feske S, Massol R, Navarro F,
Kirchhausen T, et al. Perforin triggers a plasma
membrane-repair response that facilitates CTL
induction of apoptosis.Immunity.2005;23:249
262.