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Leidy Arladis Palechor Ocampo

Lic. Biologa y Educacin Ambiental


Candidata a Magister en Biologa Molecular y
Biotecnologa

Introduccin
La fibrosis es un proceso clave en la curacin de heridas.
Los estmulos pro-fibrticos, como la lesin de las clulas
epiteliales y la apoptosis, contribuyen a la activacin de
fibroblastos circundantes e inducen la progresin de la
fibrosis

La produccin
exagerada de
colgeno puede dar
como resultado
fibrosis tisular.

Diverse Roles of TGF-/Smads in Renal Fibrosis and Inflammation


http://www.ijbs.com/v07p1056.htm

Las protenas de choque


trmico (Hsps)

Son una familia de chaperones ayudan al


plegamiento adecuado de las protenas,
participan en la produccin de citoquinas, la
inflamacin y la patognesis de las enfermedades
relacionadas con el citoesqueleto.

Las Hsp se clasifican segn el peso molecular


como Hsp 100, Hsp 90, Hsp 70, Hsp 60, Hsp 40 o
protenas de choque trmico pequeas

las Hsp 90 son las protenas ms abundantes en


clulas eucariotas y estn compuestas por cuatro
tipos principales, Hsp 90 \ alpha, Hsp 90 \ beta,
GP96 y TRAP1.

La 17-N-alilamino-17demetoxigeldanamicina (17AAG)

Es un derivado de geldanamicina que es capaz de


unirse al sitio de unin a ATP de Hsp90 y esta
unin inhibe la actividad de Hsp90. Noh et al.,
2012

Se ha demostrado que el tratamiento con 17AAG


reduce la sntesis de colgeno en las clulas
estrelladas hepticas, lo que sugiere que este
derivado puede ser til en el tratamiento de la
enfermedad heptica fibrtica.

Adems, el 17AAG disminuy la migracin celular


y atenu la formacin de la matriz extracelular.

El Hsp 90 est involucrado en la sntesis de


colgeno drmico?
Determinar la va de regulacin mediada por
Hsp 90 y sus inhibidores en la fibrosis
drmica.
Comparar los niveles de expresin de Hsp 90
entre los tejidos queloides y tejidos
normales de la piel.

Materiales y Mtodos
Cultivo celular, tejidos humanos y transfeccin de
plsmidos

Se obtuvo una lnea celular de fibroblastos drmicos


humanos de la American Type Culture Collection Las
clulas se cultivaron en medio Eagle modificado por
Dulbecco, que se suplement con suero bovino fetal al 10%
inactivado por calor, penicilina (30 U / ml) y
estreptomicina (300 g / ml).

Se obtuvieron tejidos queloides de pacientes queloides en


estadio activo (n = 4) y tejidos normales de pacientes no
queloides (n = 3).

Materiales y Mtodos

Cultivo celular

Medicin de la
viabilidad celular

Transfeccin transitoria
Incubaron con TGF- humano recombinante.
Incubaron con 17AAG por 12 horas
Aalisi RT-PCR y Western blot

La viabilidad de las clulas fibroblsticas drmicas se determin usando el ensayo CCK-8 siguiendo el
protocolo del fabricante.

La fijacin se realiz con paraformaldehdo al 4% durante 20 min a temperatura ambiente


La permeabilizacin se realiz usando Triton X-100 al 0,2% durante 10 min
el bloqueo fue seguido por tratamiento con BSA-PBS al 1% durante 1 h.
El anticuerpo primario diluido en BSA-PBS al 1% se incub con clulas durante la noche a 4C. Inmunohistoqumica
Inmunofluorescencia Se aadi anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488

Se prepararon muestras de bloques embebidas en parafina. La desparafinizacin y la rehidratacin se realizaron en soluciones graduadas de
alcohol.
Se aplic metanol que contena perxido de hidrgeno al 1% a la lmina para inhibir la actividad de la peroxidasa endgena.
Los portaobjetos se incubaron con anti-colgeno y anti-Hsp 90 durante la noche a 4 C.
Las lminas se incubaron durante 30 minutos con el anticuerpo secundario diluido contra inmunoglobulina de conejo.
Inmunohistoqumica Se aplic clorhidrato de cromgeno 3,3'-diaminobenzidina para visualizar los complejos inmunes unidos a anticuerpos.
El control negativo se ti con un anticuerpo de isotipo apareado.

Materiales y Mtodos

Anlisis estadstico

Todos los anlisis estadsticos se realizaron con Microsoft


Office Excel.
La comparacin entre los dos grupos se realiz mediante la
prueba t de Student, y no se realizaron comparaciones
mltiples debido tamao de la muestra.
Se consideraron significativos los valores de P <0,05.

Resultados y Discusin
Los efectos de Hsp 90, 17AAG y TGF- sobre
la viabilidad celular

Se evaluaron los efectos del tratamiento


con TGF- tanto en presencia como en
ausencia de sobre-expresin de 17AAG y
Hsp90 sobre la viabilidad de clulas de
fibroblastos drmicos humanos.

Resultados y Discusin
Bloqueo de la sntesis de colgeno inducida
por TGF- con 17AAG

Se utilizaron 5 ng / ml de TGF- y hasta 5 M de AAG para nuestros


experimentos. Tratamos clulas de fibroblastos drmicos humanos
con TGF- con y sin pretratamiento con 17AAG.

Resultados y Discusin

Sobreexpresin de Hsp 90 regulador


positivo de la sntesis de colgeno

Los fibroblastos drmicos humanos se transfectaron con


plsmidos Hsp 90 marcados con HA, y se realiz un
ensayo de PCR en tiempo real para evaluar la expresin
de colgeno.

Resultados y Discusin

17AAG bloquea la activacin inducida


por TGF- de la va Smad

A continuacin se examin el efecto de 17AAG en la va Smad, que se


sabe que est involucrado en TGF- inducida por la sntesis de
colgeno.

Resultados y Discusin
La sobreexpresin de Hsp 90 induce la activacin de la va Smad

La transfeccin de Hsp 90 indujo la


fosforilacin de Smad 2/3, y la
combinacin de tratamiento con
TGF- y la sobreexpresin de Hsp
90
aument
an
ms
la
fosforilacin Smad 2/3.

Resultados y Discusin
La expresin de Hsp 90 y la deposicin de
colgeno aumentan en los tejidos queloides
humanos

La tincin inmunohistoqumica revel que tanto la expresin de Hsp 90 y la deposicin de


colgeno aumentaron en los tejidos queloides en comparacin con los tejidos normales.

Conclusin

La Hsp 90 endgena puede desempear un papel en la


sntesis de colgeno en condiciones libres de estrs,
tambin se demostr que la sobreexpresin de Hsp 90
aumenta la sntesis de colgeno.

Se deben realizar estudios sobre los efectos de TGF-en


Hsp 90 en la sntesis de colgeno.

Se requieren estudios adicionales que expliquen el


hecho de que 17AAG disminuyo la expresin de Akt
total.