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Efficient Recovery of Recombinant Human Erythropoietin

from Milk of Transgenic Pigs by Two-Step Pretreatment

Carolina Vargas
David Rodriguez
Briggitte lew
Ernesto Rosales

Protenas recombinantes
en animales transgnicos

Eritropoyetina
humana(hEPO)
Glicoprotena responsable de la
regulacin de la produccin de los
glbulos rojos en los mamferos.
Expresin recombinante en leche de
cerdo
Expresin en leche de cabra no
transgnico

Desafos tcnicos
El tiempo requerido para producir
animales transgnicos
Modificaciones pos traduccionales
apropiadas
Habilidad para predecir y controlar la
expresin especifica.
Complejo proceso de Down stream

Down stream eficiente


=
proteina terapeutica segura
Impuresas
Agentes patogenos
Costo de produccion

Componente proteico de la
leche
Dos familias:
las casenas
suero de leche
La leche de cerdo transgenico contiene
niveles mas altos de proteinas nocaseinas

Mtodo de pretratamiento
Precipitacin qumica en dos etapas
Recuperacin altamente selectivo de
hEPO
Utilizando sulfato de amonio y
niveles bajo de metales divalentes

Metodos
Deconstruccin de los micelios de
casenas usando EDTA
Precipitacin por PH.
Precipitacin por sulfato de amonio
Precipitacin con Cationes divalentes
SDS-PAGE y Western-blot
Turbiedad y concentracin de protena

minacin de la concentracin de hEPO Recomb

Anlisis de rhEPO en leche


transgnica de cochina

Remocin de protenas por


precipitacin de pH.

Precipitacin con Cationes divalentes

Combinacin de sulfato de amonio y


metales divalentes

Precipitacin por sulfato de amonio

Preferencia tcnica por sulfato de amonio y


precipitacin por metales divalentes para la
recuperacin de rhEPO

Discusin
La produccin de protenas humanas recombinantes
en animales empieza a entrar en limitaciones
consistentes, bajas concentraciones, procesos de
purificacin complicados y difciles de implementar.
La leche de marrana es una mezcla muy compleja
que contiene casenas, albuminas, immunoglubinas,
otras protenas, azucares grasa y sales.
Muchos investigadores actualmente han reportado
mtodos de separacin en medios libres de
protenas por lo cual las purificaciones suelen ser
va cromatografa(afinidad, intercambio ionice
interacciones hidrofbicas)

Estos mtodos cromatgraficos han


demostrado ser ineficaces para la
purificacin de leche de marrana
para la separacin de rhEPO debido
a la presencia de cuerpos coloides y
de agregados proteicos asi como la
variedad de diversas protenas

La precipitacin por ph fue descartada ya


que mediante este mtodo el 80% de las
casenas se separaban pero ocluian a la
protena recombinante por lo cual se opto
por la precipitacin selectiva mediante
metales pesados y sulfato de amonio.
Teniendo la desventaja de estos mtodos
eran poco eficientes y al usarlos en
conjunto este mtodo de precipitacin
aumento su eficacia 5 veces

Esto resulto en una recuperacin del


82.1% y una actividad especifica de
315.2IU/mg en dos pasos de
purificacin secuencial con una ligera
modificacin de ph

CROMATOGRAFA
VENTAJA

DESVENTAJA

Precipitacin del pH

Precipitacin
sulfato de amonio

Precipitacin con
metales divalentes

RENDIMIENTO DE RECUPERACION,
82.1%
ACTIVIDAD ESPECFICA 315.2
IU/MG

Referencias
Lee, E.G., Lee, S.H., Park, K.M. et al.
Biotechnol Bioproc E (2008) 13: 189.
doi:10.1007/s12257-007-0158-x