ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DE

CHIMBORAZO
FACULTAD DE RECURSOS NATURALES
ESCUELA DE INGENIERIA AGRONOMICA
MICROBIOLOGA AGRCOLA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE
Integrantes:
Gabriela Cacoango AZOTOBACTER Y AZOSPIRILLIUM
JesseniaCastillo
Flix Pinta
 Aislamiento de Azotobacter spp

El aislamiento se realiz en agar Ashby a partir de grnulos de suelo de acuerdo con la metodologa
descrita por Novo. Luego de 3 a 8 das de incubacin a 32C, se obtuvo el crecimiento de colonias
mucoides, con pigmento oscuro caractersticas de A. chroococcum y A. nigricans. Las colonias aisladas
fueron conservadas con glicerol en una concentracin final del 50% (v/v) a - 70C (6).

Caracterizacin de Azotobacter spp Se obtuvieron 15 aislamientos a

Se realiz una caracterizacin macro y microscpica de cada
uno de los aislamientos para confirmar la morfologa tpica
de bacterias del gnero Azotobacter. Paralelamente y como
criterio de seleccin, se evalu el crecimiento en agar
Ashby-benzoato luego de 36 horas y la estabilidad de la
pigmentacin luego de tres pases sucesivos.
partir de los grnulos de suelo, de los
cuales solamente dos cumplieron con
los criterios establecidos, a stos se
les realiz una tipificacin
bioqumica utilizando la batera de
azcares al 1% (p/v): ramnosa,
sacarosa, sorbitol, fructosa, manitol y
maltosa, empleada por Jimnez
(2007) en caldo base rojo de fenol.
 La caracterizacin molecular de los dos
Adicionalmente, se realizaron pruebas aislamientos, se llev a cabo mediante el
bioqumicas en benzoato al 1% (p/v), y caldo anlisis de restriccin del DNA ribosomal 16S
nitrito las cuales se incubaron a 32C durante 48 amplificado (ARDRA) usando los iniciadores
horas. Tambin se incluyeron la prueba de oxidasa Y1 y Y3 y las enzimas de restriccin Alu I,
y peroxidasa para los dos aislamientos. Hpa II y Rsa I. Los resultados obtenidos del
ARDRA fueron comparados con la restriccin
virtual de secuencias equivalentes de bacterias
fijadoras de nitrgeno obtenidas del
Genebank.
Se realiz una cintica de crecimiento partiendo de un
inculo con una concentracin celular de 3x108
UFC/ml, con relacin utilizando caldo nutritivo. El
cultivo se incub a 30C y 120 rpm. El crecimiento fue
monitoreado por turbidimetra registrando la
absorbancia a 540 nm cada 6 horas durante 72 horas con
el fin de obtener las UFC/ml. La velocidad de
crecimiento se emple como ltimo criterio de seleccin
para la cepa que finalmente se utiliz en la produccin
del biofertilizante.
 Aislamiento e identificacin de cepas de Azospirillum sp.
El aislamiento de las bacterias del
gnero Azospirillum resulta en lo
general muy simple, ya sea a partir
de suelo rizosfrico o de la superficie
de las races (rizoplano) de
numerosas plantas hospederas.
Tambin se le aisla del interior de las
races o tallos de algunas plantas. El
medio de cultivo usado por
excelencia para el enriquecimiento
de las especies de Azospirillum ha
sido el NFb semigelificado "libre" de
nitrgeno y con malato como fuente
de carbono.
No obstante, en este medio de cultivo son aisladas
predominantemente cepas de las especies A.
lipoferum y A. brasilense. El medio NFb con algunas
modificaciones en su composicin y pH permiten el
aislamiento predominante de otras especies
de Azospirillum.
Estos medios son usados frecuentemente para evaluar la
actividad reductora de acetileno, como indicativo de la
fijacin de nitrgeno. Tubos en los cuales se observa el
crecimiento bacteriano en forma de sombrilla, la cual se
transforma en una pelcula blanca y densa abajo de la
superficie del medio de cultivo, y vire del indicador azl de
bromotimol son considerados tentativamente como positivos
para el aislamiento en cultivo puro de la bacteria.
El cultivo puro se logra en diferentes medios de laboratorio, siendo muy
comunmente usado un medio adicionado del colorante rojo Congo, en el
cual A. lipoferum y A. brasilense toman un color rojo escarlata que
permite la diferenciacin de otros gneros bacterianos.

Aun cuando el medio BLCR fue diseado para mejorar el

aislamiento de cepas de Azospirillum brasilense, su uso no
fue aceptado por haberse demostrado que no era apropiado
para el estudio de poblaciones naturales de esta bacteria.
Posteriormente se observ que la concentracin de
estreptomicina usada (200 mg/litro) en el medio BLRC era
inhibitoria del crecimiento de un gran nmero de cepas.

Adems de los medios y mtodos descritos,

tambien existen reportados algunos medios de
cultivo y mtodos para el crecimiento
de Azospirillum en cultivo puro y en asociacin con
plantas, as como para su conservacin.
 Identificacin de cepas de Azospirillum sp.

El gnero Azospirillum pertenece a la subclase alfa de las

proteobacterias, siendo A. lipoferum la especie tipo. Caractersticas
tiles en la identificacin rutinaria son la forma vibroide, el
pleomorfismo y su movilidad en espiral. Las clulas contienen
cantidades elevadas de poli--hidroxibutirato (PHB), hasta 50% del
peso seco celular, observndose al microscopio las clulas jvenes con
abundantes granulos refringentes.

En forma complementaria para la identificacin

fenotpica de las especies de Azospirillum pueden ser
usadas diversas tcnicas inmunolgicas. La
aglutinacin en tubo, tcnicas de precipitacin en
capilar, inmunoelectroforesis, inmunofluoresencia e
inmunodifusin fueron mtodos usados exitosamente
en la identificacin y numeracin de Azospirillum spp.
En cultivos semigelificados y gelificados
con mas de 24 h de incubacin se presentan
frecuentemente clulas refringentes con
forma ovoide y de paredes gruesas
similares a quistes.
 S U
OR
P
S
A N
C I
A I
R NC