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Universidade Federal da Bahia

CARACTERIZAO E
IMS - Campus Ansio Teixeira
Cultura de Tecidos Vegetais

DESENVOLVIMENTO DA EXPRESSO
DE GENES QUE CODIFICAM ENZIMAS
BIOSSINTTICAS DE CAROTENIDES
INICIAS EM Citrus paradisi macf.
Elvira Maria Brito Cndido
Vida Marina Barreto Leite
CAROTENIDES 3

Pigmentos isoprenoides;

Classificados em 2 grupos:

- Carotenos (alfa-caroteno e betacaroteno);

- Xantofilas (violaxantina e zeaxantina).


CAROTENIDES 4

Metabolizados em cido abscsico e vitamina A;

Agentes corantes e agentes de disperso de sementes;

Acumulam-se em cromoplastos fotossintetizantes;

Licopeno

O processo de acumulao de carotenides em cromoplastos tem sido


extensivamente estudado em amadurecimento frutos de tomate por causa das
intensas mudanas de cores que ocorrem durante este processo.
CAROTENIDES 5

Regulao diferencial da transcrio desempenha um papel importante.

Fitoeno-sintetase (PSY)

Fitoeno desaturase (PDS) aumentam 4-20 vezes durante o amadurecimento.

Enquanto que ciclases de licopeno (LCYB e LCYE) desaparecem. (produzem


- e betacaroteno).
CAROTENIDES EM CITRUS 6

Os carotenides so responsveis pela caracterstica amarelo, laranja e


vermelho coloraes de citrinos maduro;
Composio de carotenides na casca do fruto difere do endocarpo da fruta;
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CAROTENIDES EM CITRUS

Na maturao de citros, o aumento de carotenides no linear;

Os genes que codificam enzimas da via biossinttica de carotenides foram


identificados em laranjas, limes e mandarinas e sua expresso investigada em
casca e polpa de estas espcies durante o amadurecimento da fruta.
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Grapefruit (C. paradisi Macf.)
Hbrido: cruzamento entre um pomelo
(Citrus grandis L. Osb.) e uma laranja doce
(C. sinensis L. Osb.), no sculo XVIII nas
ndias Ocidentais.
A composio de carotenides de

grapefruit difere da maioria das frutas

ctricas.
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Objetivos
Identificar e caracterizar os genes que codificam as enzimas biossintticas de
carotenides no incio da via dos carotenides de toranja (CpPSY CpPDS, e
CpZDS);
Propor um mecanismo molecular da acumulao de licopeno na toranja
vermelha com base nestes dados.
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Materiais e Mtodos
MATERIAL VEGETAL

Coleta das amostras de frutos de grapefruit (Citrus paradisi Macf.).

Variedades Ducan e Flame.

Coletados no Citrus Research e Centro de Educao (CREC).

As amostras de frutos foram mantidos a -80 C at sua utilizao


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Isolamento de RNA e sntese de cDNA
O RNA total foi isolado a partir de tecido da vescula albedo e suco das variedades
de toranja, utilizando o protocolo descrito por Chang et al;
RT-PCR;

A transcrio reversa foi realizada utilizando o kit RETROscript;

A pureza e a concentrao das amostras de RNA isoladas foram verificados em 1%


de gis de agarose e em um espectrofotmetro.
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Clonagem molecular de C. paradisi PSY,
PDS, e o cDNA de zDS por RACE
Para o isolamento de PSY, PDS, e os fragmentos DNAc ZDS, iniciadores senso e
anti-senso foram sintetizados com base nas regies conservadas dos respectivos
genes da biossntese de carotenides;
Os fragmentos de DNAc amplificados foram clonados no vector pGEM-T utilizando
o sistema de clonagem TA;
Reaes de amplificao rpida de extremidades de DNAc (RACE), utilizando o
SMARTTM RACE kit de amplificao de DNAc.
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Prever as sequncias de codificao dos genes CpPSY, CpPDS, e CpZDS.

Alinhamentos de sequncias foram deduzidos com o programa de software


ClustalW.

rvores filogenticas foram gerados utilizando o mtodo de Neighbor-Joining,


incluso no programa ClustalW e os dendogramas foram construdos pelo
programa MEGA4.

Anlises de bioinformtica
A abundncia relativa dos mRNAs CpPSY, CpPDS e CpZDS mRNAs foi avaliada 13
empregando o kit QuantumRNA.
Amostras dos tecidos do fruto de ambas as variedades foram recolhidas uma vez por
ms, de maio a fevereiro.
PCR

1min 1min 2min


1 93C 2 60C 3 72C

35 ciclos

RT-PCR quantitativo
Os produtos da amplificao por PCR foram separados por electroforese em
gis de agarose a 2% e depois transferidos para membranas de nylon.

As membranas foram tomadas atravs do procedimento de deteco


quimioluminescente DIG, como recomendado pelo fabricante (Roche).

Os produtos da PCR foram quantificados usando o programa AlphaEase


V5.5.

RT-PCR quantitativo