CIDO NUCLEICOS

Replicacin del ADN

Biologa NS-Diploma BI

Idea Fundamental: La estructura del ADN

se adapta de forma ideal a su funcin,
permitiendo que la informacin gentica
que contiene sea copiada de forma precisa.
 BASE QUMICA DE LA HERENCIA
El ADN es la molcula portadora de la informacin gentica gracias a
que cumple cuatro condiciones imprescindibles:
1. Debe poder contener cualquier tipo de informacin biolgica. Al ser
una macromolcula formada por cuatro tipos de nucletidos y al tener
un gen miles de pares de nucletidos, las combinaciones son casi infinitas.

IMAGEN: www.educarchile.cl

IMAGEN: www.livescience.com
 Base qumica de la herencia
2. Debe ser resistente a las alteraciones (mutaciones). Si por
cualquier razn se coloca un nucletido incorrecto, se aparea
inadecuadamente con el complementario, por lo que la doble hlice queda
alterda. La clula posee mecanismos para reconocer el error, eliminar el
nucletido incorrecto y sustituirlo por el correcto. No obstante, la posibilidad
de mutacin no debe ser nula con objeto de promover la evolucin.
IMAGEN: cuadernodeanamartinezcollado.blogspot.com
 BASE QUMICA DE LA HERENCIA
3. Duplicacin. Las clulas hijas reciben la misma informacin que la
progenitora. Para esto, basta con que se separen las dos cadenas de la
hlice y se sintetice, junto a cada una, la complementaria.

IMAGEN: www.lookfordiagnosis.com
 Base qumica de la herencia
4. Transcripcin de la informacin. El obligado emparejamiento de
nucletidos complementarios permite a la clula copiar en un ARN
mensajero la secuencia complementaria de una de las hebras. Esta
secuencia complementaria puede ser luego traducida en forma de
protena, segn las normas del cdigo gentico.
 Flujo de la informacin gentica
El ADN porta la informacin gentica, es decir,
proporcionan la nuestros
informacin, pero son las protenas las que
genes
realizan el trabajo.
Cmo se expresa la informacin gentica contenida en el ADN? Cmo
pasa la informacin desde el ADN hasta las protenas que la ejecutan?

IMAGEN: www.biogeo.iespedrojimenezmontoya.es
 Redefinicin del dogma central de la
Biologa Molecular
Ciertos virus (retrovirus) pueden realizar la
(retrotranscripcin) ya que
transcripcin al poseen
revs una enzima llamada transcriptasa
inversa o retrotranscriptasa, que fabrica ADN complementario a un
ARN molde.

IMAGEN: www.aportes.educ.ar

Otros virus (virus de ARN) son capaces de replicar el ARN.

Ciertas protenas (priones) tienen la capacidad de autoperpetuarse
convirtiendo las normales en defectuosas.
 Demostracin del ADN como material gentico
Aunque actualmente se sabe con certeza que el ADN porta la informacin
gentica, esto no pudo demostrarse hasta la segunda mitad del siglo XX.

A finales del siglo XIX los cientficos estaban convencidos de que los
cromosomas jugaban un papel clave en la herencia, y de que el material
hereditario tena una naturaleza qumica.
Como se saba que los cromosomas estaban formados de tanto protenas
como de cidos nucleicos, ambos eran firmes candidatos a ser el material
gentico.
Durante la primera mitad del siglo
XX se supona que eran las
protenas las que portaban la
informacin que determina la
herencia, dada la gran variedad
de funciones que llevaban a cabo,
as como a su especificidad.
Variedad y especificidad de
funciones eran dos requerimientos
que se crean indispensables en el
IMAGEN: http://slideplayer.com/slide/6134255/
material gentico.
 Demostracin del ADN como material gentico
La primera prueba de que los genes estaban formados por ADN procede
de los experimentos de transformacin bacteriana realizados por
Fred Griffit en 1928.
Existan dos cepas de la bacteria Streptococcus pneumoniae: Una
patognica encapsulada, denominada S porque que al sembrarla en placa
producan colonias lisas, y otra no patognica sin cpsula, denominada
cepa R sin cpsula, que producan colonia rugosas.
Demostracin del ADN como material gentico
F. Griffit descubri que al
mezclar bacterias
muertas (S)
virulentas
con no virulentas
vivas
(R), las ltimas se haban
transformado en S,
podan formar cpsula y
adquiran patogenicidad.

La sustancia que pasaba
de las bacterias L
muertas a las R vivas, y
transformaba a sta
principio
ltima en S, el
transformante, no
pudo aislarse.
Demostracin del ADN como material gentico
En 1944 Avery, McLeod y McCarty identificaron dicho principio
transformante como ADN.
El lisado de bacterias S
(el contenido bacteriano
tras su rotura) lo
mezclaron con bacterias
R vivas, las cules se
transformaban en S y
mataban a las ratas.
Comprobaron que de
todas las sustancias
presentes en el lisado
bacteriano (protenas,
azcares, cidos
nucleicos y
el ADN produca
lpidos) dicha
slo
transformacin.
IMAGEN: biology.kenyon.edu
HABILIDAD: Experimento de Hershey y Chase que
probaba que el ADN es el material gentico
En 1952 Hershey y Chase realizaron un experimento que
proporcionaba pruebas de que el ADN es el material gentico.
En ese momento se saba
que los fagos (virus que
infectan bacterias, como
el fago T2) introducan su
material gentico dentro
de las
bacterias que
infectaban, utilizando su
maquinaria molecular para
obtener nuevas partculas
vricas que eran liberadas
al medio.
IMAGEN:
discoveryandinnovation.co
m
Los fagos estn formados solo de ADN y protenas, por lo que el objetivo
Hershey y Chase era determinar cul de estas molculas era el material
gentico que los fagos inyectaban en las clulas hospedadoras.
HABILIDAD: Experimento de Hershey y Chase que
probaba que el ADN es el material gentico
En un primer experimento, marcaron el ADN de los fagos con el istopo
radiactivo del fsforo (P32), dado que los aminocidos que forman las
protenas carecen de l.
Dejaron que los fagos del cultivo infectaran a las bacterias E. coli y
posteriormente retiraron las cubiertas proteicas de las clulas infectadas
mediante una licuadora y una centrfuga, quedando las bacterias en el
fondo del tubo y las cubiertas proteicas en el sobrenadante.

IMAGEN: http://biology-irsc.weebly.com

Encontraron que el indicador radiactivo era visible slo en las clulas

bacterianas, y no en las cubiertas proteicas.
HABILIDAD: Experimento de Hershey y Chase que
probaba que el ADN es el material gentico
En un segundo experimento, marcaron los fagos con el
istopo radiactivo del azufre (S35), que contienen los aminocidos
cistena y metionina, a diferencia del ADN.
Tras la separacin, encontraron que el indicador estaba presente en las
cubiertas proteicas, pero no en las bacterias infectadas.

IMAGEN: http://biology-irsc.weebly.com

Dado que solo el ADN del bacterifago era introducido en la bacteria y

era usado para producir ms bacterifagos, se confirm que el ADN es el
material gentico.
 Conservacin de la informacin gentica
Como ya se ha indicado, la
informacin gentica fluye desde el
ADN hasta el ARN (transcripcin)
y desde ste a las protenas
(traduccin).
Sin embargo, la informacin IMAGEN: www.biologia.arizona.edu
gentica tambin
debe
conservarse, de manera que se
transmita de una clula progenitora
a la descendencia (replicacin).
La replicacin del ADN consiste en
duplicarlo, ya que se hace una
copia idntica de un molde.
Si una clula va a dividirse por
mitosis, cada clula hija debe
la misma informacin
recibir
gentica. Por tanto, la replicacin
por la que la clula madre duplica
su ADN ocurre durante la fase S. IMAGEN: ciencia.cl
 Conservacin de la informacin gentica
Durante la replicacin, las dos hebras o
filamentos de la doble hlice se separan,
sirviendo cada uno de ellos como gua o molde
para la creacin de una nueva cadena por
adicin de nucletidos.
El resultado es que en la doble hlice de la
molcula de ADN de cada clula hija se
conserva una cadena original de la clula
madre (la cadena molde) mientras que la otra
cadena se sintetiza de nuevo.
La secuencia de bases en una cadena
determina la secuencia de bases en la otra
cadena, al solo establecerse puentes de
entre las bases que son
hidrgeno
complementarias.
Por esta razn, se dice que la replicacin del
ADN es semiconservativa y depende del
apareamiento de bases complementarias.
 Replicacin semiconservativa
Varias fueron las evidencias experimentales que permitieron concluir la
estructura del ADN: el uso de modelos moleculares, cuyo pionero fue
Linus Pauling, el patrn de difraccin de rayos X de Rosalind Franklin y los
estudios sobre la composicin de bases de Erwin Chargaff.
Uno de los primeros
modelos del ADN pensados
por Watson y Crick, tena las
bases nitrogenadas
orientadas hacia el exterior
de la molcula. Franklin
contrargument este modelo
sobre la base de que las
bases nitrogenadas son
hidrofbicas y por tanto,
deberan estar orientadas IMAGEN: http://undsci.berkeley.edu/
hacia el interior de la hlice.
Los estudios de difraccin de Franklin mostraban que la hlice estaba
fuertemente compactada, por lo que las bases deban estar muy juntas en
los modelos que estaban desarrollando Watson y Crick.
 Replicacin semiconservativa
Como hicieron varias pruebas, IMAGEN: http://undsci.berkeley.edu/

comprobaron que las bases se

ajustaban mejor cuando las purinas se
enfrentaban a pirimidinas, y adems,
cuando lo hacan en una orientacin
inversa.
Adems de la similitud estructural, la
adenina tiene una carga negativa,
compatible con la carga positiva
mostrada por la timina. Por otro lado, el
apareamiento entre guanina y citosina
require de 3 enlaces de hidrgeno,
aadiendo estabilidad a la molcula.
Una vez que el modelo fue propuesto
en base a la complementariedad de
bases, la estructura del ADN sugera
una mecanismo para la relicacin
del ADN, sugiriendo la hiptesis de una
replicacin semiconservativa.
NATURALEZA CIENCIAS: Obtencin de pruebas
a favor de teoras cientficas
Mediante este modelo semiconservativo, las dos cadenas de la doble
hlice se pueden separar y cada cadena polinucleotdica sirve de molde
para la sntesis de una nueva cadena de ADN, siguiendo la regla de la
complementariedad de bases.
Cada nueva molcula de
ADN resultante presenta
un filamento antiguo y otro
nuevo complementario.
Otra posibilidad que se
barajaba es que la
replicacin fuera
conservativa, donde se
forma una nueva hlice y
se conserva entera la doble
hlice primitiva, o bien
dispersiva, donde ambos
filamentos estn formados
por una mezcla de nuevo
y antiguo.
NATURALEZA CIENCIAS: Obtencin de pruebas
a favor de teoras cientficas
En 1958 Meselson y Stahl lograron pruebas a favor de la
replicacin semiconservativa del ADN usando istopos radiactivos.
El istopo de nitrgeno normal es N14, mientras que el istopo radiactivo
(N15), es ms denso al tener un neutrn ms.
Meselson y Stahl desarrollaron
un nuevo mtodo para separar
molculas de ADN conteniendo
N14 de aquellas que contienen
N15.
Esta tcnica, denominada
ultracentrifugacin
en
gradiente de densidad de
cloruro de cesio, permite
separar molculas en funcin de
su densidad de flotacin, es decir,
que las molculas se concentran
como bandas donde la densidad
de las molculas iguala a la de la
solucin a su alrededor. IMAGEN: www.javeriana.edu.co
NATURALEZA CIENCIAS: Obtencin de pruebas
a favor de teoras cientficas
Cuando se cultivan bacterias de E. coli con nucletidos radiactivos del
istopo N15, todo su ADN esta formado por dicho istopo pesado. Por
otro lado, cuando se hace lo mismo pero con el istopo N14, todo su ADN
esta formado por dicho istopo ms ligero.
As, cuando se centrifuga una muestra formada por molculas de ADN
fabricadas con N14 y otras fabricadas con N15, stas ltimas, al tener una
mayor densidad se colocan en el fondo del tubo de ensayo tras ser
centrifugada la mezcla.
IMAGEN: www.bionova.org.es
HABILIDAD: Anlisis de los resultados de Meselson y Stahl
Meselson y Stahl cultivaron bacterias de E. coli durante 14 generaciones
con nucletidos radiactivos del istopo N15, de manera que todo su ADN
estaba formado por dicho istopo pesado.
Pasaron dichas bacterias a un medio con nucletidos ms ligeros con el
istopo N14, y extrajeron ADN despus de cada generacin.
1. Tras 0 generaciones haba una nica
banda de ADN con una densidad de
1.724 g/cm3. Tras 4 generaciones la
banda principal tiene una densidad de
1.710 g/cm3. Explique cmo se ha
producido este ADN de menor
densidad.
2. Estime la densidad del ADN despus
de 1 generacin.
3. Explique si la densidad del ADN tras 1
generacin falsifica alguno de los
modelos de replicacin.
4. Describa los resultados
despus de 2
generaciones, y si
IMAGEN: commons.wikimedia.org
falsifica alguno de los
 NATURALEZA CIENCIAS: Obtencin de pruebas a
Cultivo
bacteriano transferidas
favor de teoras cientficas
Bacterias

en medio a un medio
con15N con 14N
Como se ha indicado, Meselson y
Muestra Muestra Stahl pasaron bacterias de E. coli a
de ADN de ADN Menos un medio con nucletidos con el
centrifug centrifugad denso istopo N14 tras haber sido
ada a despus
despus 40 min
Ms cultivadas durante 14 generaciones
20 min (despus 2
denso con nucletidos del istopo N15.
(despus replicacin) 2 replicacin
1 1 replicacin Extrajeron ADN despus de la 1 y
Modelo
replicaci
conservati
n)
2 generacin.
vo
La primera replicacin produjo
una banda hbrida de ADN, lo que
Modelo invalidaba el modelo conservativo.
semiconserv
ativo La segunda replicacin produjo
tanto una banda hbrida como una
ms ligera, invalidando el modelo
Modelo dispersivo y apoyando el modelo
dispersiv
o semiconservativo.
HABILIDAD: Anlisis de los resultados de
Meselson y Stahl

Animacin1
Web5
 Proceso de replicacin
Para que un ser humano se desarrolle a partir de un cigoto, se calcula
que deben producirse unas mil billones de divisiones celulares, con otras
tantas replicaciones previas de ADN.
La replicacin del ADN se produce durante la fase S (interfase) del ciclo
cellular.
 Proceso de replicacin
La replicacin del ADN es llevada a cabo por un
de enzimas que complejo sistema todo un aparato
constituye molecular de
replicacin llamado replisoma.

Enzima Funcin
Helicasa Desenrolla la doble hlice y separa las dos cadenas
mediante la ruptura de los puentes de hidrgeno entre
las bases nitrogenadas de ambas cadenas.
Topoisomerasa (girasa) Elimina las tensiones originadas al desenrollar las dos
cadenas.
Protenas de unin de Se unen a las hebras molde del ADN para que no se
cadena simple (SSB) vuelvan a enrollar.

Primasa Fabrica un corto fragmento de ARN en direccin 5-3

que proporcione el extremo 3 hidroxilo sobre el que
adicionar los nuevos nucletidos la ADN polimerasa.
ADN polimerasa Aade y une entre s los nucletidos para formar una
nueva cadena.
ADN ligasa Une entre s los distintos fragmentos de Okasaki hasta
formar por completo la hebra retardada.
 Replicacin en procariotas
La replicacin comienza en un punto concreto del
cromosoma
denominado origen bacteriano
de replicacin (oriC), a partir del cual se forman
unas estructuras conocidas como burbujas de replicacin, que se
extienden, en sentido contrario, a lo largo del cromosoma dando lugar a
dos horquillas de replicacin, en las cuales las dos hebras de ADN
parental estn separadas y actan como moldes para la sntesis de dos
nuevas cadenas de ADN (replicacin bidireccional).

En la replicacin del ADN se distinguen las siguientes

fases: Iniciacin, elongacin y terminacin.
Replicacin en procariotas: Iniciacin
Consiste en el desenrollamiento y
apertura de la doble hlice, dado
que antes de que la replicacin
pueda ocurrir, la doble cadena
debe separars para que cada
una actee como molde para la
formacin de la nueva hebra.
Esta separacin es llevada a cabo
por la enzima helicasa mediante
la hidrlisis del ATP.

enzima helicasa
La desenrolla la doble
hlice y separa las dos
cadenas mediante la
ruptura de los puentes
de hidrgeno entre las
bases nitrogenadas de
ambas cadenas.
 Replicacin en procariotas: Iniciacin
Una de las enzimas helicasas ms estudiadas es una protena con
estructura cuaternaria formada de seis polipptidos, si bien hay otras
helicasas ms simples, de tal modo que conforma una estructura en
forma de anill que desenrrolla el ADN. Esta estructura se
o desplaza por una de las
IMAGEN: www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar
hebras y fuerza su paso
a travs de los pares de
bases de la molcula de
ADN doble. Las esferas
rojas representan las
molculas de ATP
que
proporcionan la energa
para que la enzima se
desplace a lo largo de la
molcula de ADN y
rompa los enlaces de
hidrgeno entre las
bases nitrogenadas
de
ambas cadenas.
 Replicacin en procariotas: Iniciacin
Adems intervienen las
topoisomerasas (como la
girasa) que eliminan las
tensiones originadas al
desenrollar las dos cadenas.
Luego las protenas de
union de cadena simple
(SSB) se unen a las hebras
molde del ADN para que no
se vuelvan a enrollar. Ahora
ya pueden actuar las ADN-
polimerasas que leen la
Video3 secuencia de cada una de
las cadenas y elaboran dos
rplicas con
secuencias
complementarias.
 Replicacin en procariotas: Elongacin
En E.coli hay tres ADN polimerasas, la I y la III que se encargan de la
replicacin y correccin de errores, y la II, que slo lleva a cabo la
replicacin del ADN daado por determinados agentes fsicos.
 Replicacin en procariotas: Elongacin
La que desempea el papel principal es la ADN polimerasa III, que tiene
como sustrato los desoxirribonucletidos trifosfato (ATP, TTP, GTP y
que
CTP),los hidroliza en pirosfato (PP) y nucletido monofasfato, el cul une
a la cadena de ADN en formacin mediante enlace fosfodister.

La ADN polimerasa une entre s los nucletidos para formar una

nueva cadena, usando para ello la cadena preexistente como una
plantilla.
 Replicacin en procariotas: Elongacin
La ADN polimerasa III es incapaz de iniciar por s sola la sntesis de una nueva
cadena de ADN, por lo que necesita un corto fragmento de ARN llamado ARN
cebador (primer) que proporcione el extremo 3 hidroxilo sobre el que
los nuevos
adicionar nucletidos.

Este ARN es sintetizado por una ARN polimerasa denominada

cebador
primasa, que fabrica un corto fragmento de ARN en direccin 5-3.
 Replicacin en procariotas: Elongacin
La ADN polimerasa III slo puede adicionar nucletidos al extremo
lo que el crecimiento de la nueva hebra siempre ser en direccin 5-3.
3, por

Esto hace que el molde que va de 3- (denominado cadena conductora

5 o adelantada) sea copiado de manera continua, pero que la otra cadena
(retardada), al ir de 5-3, sea copiada de forma discontinua, a trozos
que s van de 5-3, denominados fragmentos de Okasaki.
 Replicacin en procariotas: Terminacin
El final de la replicacin se produce cuando la ADN polimerasa III se
encuentra con una secuencia de terminacin.
La ADN polimerasa I elimina los ARN
cebadores, sustituyendo sus huecos por ADN.

Animacin2

Por ltimo una ADN ligasa une entre s los

distintos frgamentos hasta formar por
completo la hebra retardada.

La cadena lder se forma ms rpidamente, ya que slo se necesita un

cebador de ARN al principio, y por tanto solo acta una vez la ADN
polimerasa I y la ligasa.
 Replicacin en procariotas: Terminacin
Una vez duplicado el ADN circular, las molculas hijas resultantes
vinculadas entre s, por loestnque deben ser desencadenadas para
segregarlas en clulas hijas separadas.
Esta separacin las realizan otras enzimas topoisomerasas, que tienen
capacidad para romper una molcula de ADN bicatenario y hacer pasar
una segunda molcula de ADN bicatenario a travs de la rotura.
 Replicacin en eucariotas
Es similar a la de procariotas, es decir, semiconservativa y
bidireccional, existiendo una hebra conductora que se sintetiza de
manera continua y una retardada de forma discontinua con fragmentos
de Okazaki.
Sin embargo, existen cuatro grandes
diferencias:
1. Existen cinco tipos de ADN polimerasas.
2. El ADN de los eucariontes est fuertemente
asociado a los octmeros de histonas, en
forma de nucleosomas, por lo que adems
de replicarse el ADN, deben duplicarse
tambin las histonas. Al parecer, tanto los
nuevos nucleosomas como los antiguos se
reparten entre las dos nuevas hebras hijas, en
la retardada y en la conductora.

IMAGEN: http://bio3400.nicerweb.com
 Replicacin en eucariotas
3. La longitud del ADN de un cromosoma eucaritico es mucho
bacteriano, por lo que no hay un
mayor quenico origen de replicacin y en los cromosomas
el ADN
eucariticos la replicacin del ADN se inicia en muchos puntos diferentes
(replicones). Parental (molde) cadena
Origen de replicacin 0.25 m
Hija (nueva) cadena

Burbuja Horquilla de
replicacin

Dos molculas de ADN hijas

En eucariotas, la replicacin comienza en muchos Micrografa donde se observan tres

sitios distintos del ADN de cada cromosoma. burbujas de replicacin en el ADN
de un cultivo de clulas de hamster.
 Replicacin en eucariotas
4. Los cromosomas eucariotas son lineales y presentan en sus extremos unas
regiones, denominadas telmeros, constituidas por secuencias repetitivas.
Cuando se replica el ADN lineal, los extremos 5 de los telmeros, no pueden
ser replicados, ya que cuando se elimina el ltimo cebador, la ADN polimerasa
no podr rellenar el hueco al no encontrar extremos hidroxilo libres. Debido a
esto, el extremo del cromosoma se va acortando cada vez que la clula se
divide. Esto se asocia al envejecimiento y muerte celular.
 Replicacin en eucariotas
El acortamiento de los telmeros, puede ser remediado mediante una enzima,
la telomerasa, que repara el dao y hace a las clulas inmortales, es el
caso de las clulas embrionarias y tumorales.
La telomerasa es una ribonucleoprotena que acta como transcriptasa
inversa, ya que tienen una hebra de ARN con la secuencia apropiada para
actuar como molde para la sntesis de la secuencia telomrica de ADN que se
aade en los extremos 3 de cada cromosoma para evitar su acortamiento en
cada proceso de duplicacin.
Replicacin en procariotas: Correccin de errores
En E. coli la actividad polimerasa
de estos enzimas comete un error
de apareamiento por cada milln
de nucletidos adicionados (106).
La actividad exonucleasa
autocorrectora de las ADN
polimerasa I y III consituye el
principal mecanismo de correccin
de errores, reduciendo el error a
uno de cada cien millones de
nucletidos adicionados (108).

IMAGEN: http://bio3400.nicerweb.com
Replicacin en procariotas: Correccin postreplicativa
Esta precisin podra resultar suficiente para una bacteria, cuyo genoma
contiene 3106 pares de bases, pero resulta insuficiente para el genoma
humano que contiene 3109 pares de bases.
Un error por cada 10 millones de bases supondra 300 equivocaciones en
cada duplicacin del ADN humano, y teniendo en cuenta que durante el
desarrollo embrionario a partir del cigoto el genoma humano se duplica
casi mil millones de veces, se producira una acumulacin del trescientos
mil billones de errores, lo que evidentemente, es incompatible con la
vida, ya que la formacin inicial se perdera pronto como consecuencia
de las divisiones celulares.

IMAGEN: http://bio3400.nicerweb.com
Replicacin en procariotas: Correccin postreplicativa
Por ello, para aumentar la precisin de la replicacin, existe una
maquinaria enzimtica que corrige posibles errores cometidos por las
recien sintetizado (adeninas no metiladas), que se
polimerasas en el ADN
denomina correccin con lo que la exactitud de la
postreplicativa,
rplica alcanza la increble perfeccin de 1 error por cada 1010 nucletidos.
Participan endonucleasas, que cortan la cadena donde se detecta el error,
exonucleasas, que eliminan el fragmento incorrecto, ADN polimerasa
que sintetiza el segmento correcto y ADN ligasa para unir el nuevo
segmento al resto de la cadena.
APLICACIN: Uso de la Taq polimerasa en la PCR
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica de
ingeniera gentica desarrollada por Kary Mullis (Premio Nobel en 1993) y
consistente en la obtencin de mltiples copias de una
secuencia
de ADN concreta.

Si recogemos una pequea muestra de ADN, podemos usar la PCR para

amplificarla, ya que utiliza la enzima ADN polimerasa para hacer ms
copias del ADN molde.
APLICACIN: Uso de la Taq polimerasa en la PCR
La PCR consta de un ciclo de tres fases: calentamiento, enfriamiento y
replicacin:
1. Elevando la temperatura a 94C
durante 1 minuto, se desnaturaliza
el ADN mediante la rotura de los
puentes de hidrgeno.
2. Disminuyendo la temperatura a
54C durante menos de 1 minuto, se
promueve que se unan (hibriden)
primers/cebadores al comienzo y
final de la seccin de ADN que se
quiere amplificar.
3. Elevando la temperatura a 72C
durante 2 minutos, las cadenas de
ADN se mantienen desnaturalizadas
de manera que la ADN polimerasa
aade nucletidos complementarios a
razn de 1 000/minuto amplificando
la secuencia del ADN especfico.
APLICACIN: Uso de la Taq polimerasa en la PCR
5 3
Target La ADN polimerasa utilizada debe ser
sequence
termoestable y no desnaturalizarse a
5
altas temperaturas, por lo que se usa
Genomic DNA 3

Denaturation:
Heat briefly
5 3
la enzima de la bacteria Thermus
to separate
DNA aqueaticus (taq ADN polimerasa)
strands 3 5 en fuentes termales (50-
Annealing: encantrada
Cycle 1
Cool to allow 80 C), como las del Parque Nacional
primers to form
yields hydrogen bonds Primers
2 with ends of de Yellowstone.
molecules target sequence
Extension:
DNA polymerase
adds nucleotides to New
the 3 end of each nucleo-
primer tides

Cycle 2
yields
4
molecules
Repitiendo este ciclo, la Taq ADN
Cycle 3 polimerasa puede usarse para
yields 8
molecules; producir mltiples copias de ADN
2 molecules
(in white boxes) rpidamente mediante la reaccin
match target
sequence en cadena de la polimerasa (PCR).
 APLICACIN: Secuenciacin del ADN
En la actualidad se han secuenciado los genomas de muchos seres vivos,
tanto animales, como platas, hongos, algas, protozoos y bacterias.
En el proceso de secuenciacin, se usan nucletidos que contienen
acido didesoxirribonucleico con el fin de detener la replicacin
del ADN en la preparacin de muestras para la secuenciacin de
bases.

Muchas copias del fragmento de

ADN que quiere secuenciarse
son colocadas en un tubo de
ensayo junto con todo
lo
para que puede
necesario
replicarse, es decir, la enzima
ADN polimerasa,
los
desoxirribonucletidos trifosfato
y un primer/cebador que marca
el punto de inicio de la
replicacin.

IMAGEN: http://bio3400.nicerweb.com
 APLICACIN: Secuenciacin del ADN
Adems, se coloca una menor concentracin de didesoxirribonucletidos
que carecen de grupo hidroxilo en el C3 de la pentosa (por lo que no
pueden unirse al fosfato del C5 de otro nucletido) y que llevan
incorporados un marcador fluorescente emite luz de distinto
que color
cuando son irradiados.

IMAGEN: boundless.com

El proceso de replicacin tiene lugar, pero a

medida que uno de los ddNTP se aade, la
IMAGEN: http://bio3400.nicerweb.com cadena en construccin se detiene en ese
punto, teniendo un tamao especfico y un
color de fluorescencia determinado.
APLICACIN: Secuenciacin del ADN
Las distintas cadenas de diferente tamao sintetizadas y
que terminan en un nucletido de fluorescencia concreta,
son separados en funcin de su tamao mediante
electroforesis en un gel de agarosa.
Un lser estimula a los dideoxinucletidos de manera
que cada fragmento emita fluorescencia, que es detectada
mediante un detector ptico, registrando una serie de
picos de fluorescencia.

Un ordenador deduce la
secuencia de bases a
partir de la secuencia de
colores detectada.

IMAGEN: upload.wikimedia.org
IMAGEN: http://bio3400.nicerweb.com