INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE
CIENCIAS BIOLGICAS
Seminario: Induccin de mutaciones
en Escherichia coli.

Laboratorio de Gentica Microbiana

Grupo: 5QM1 Equipo:6
Integrantes :
Hernndez Estrada J. Tonatiuh.
Hernndez Rodrguez Montserrat
Martnez Flores Giovanny
ANTECEDENTES
Mutacin
Es un cambio en la secuencia de bases de un segmento de
DNA, que es heredable y que no es generado por el proceso
de recombinacin gentica.

Fig. 1 Replicacin del

DNA
 Locus: Posicin fija en un cromosoma, como la
posicin de un gen o de un marcador (marcador
gentico).

Mutgeno: Agente fsico, qumico o biolgico que

altera o cambia la informacin gentica de un
organismo.

Gen: Secuencia nucleotdica, que puede transcribirse

expresarse.

Genotipo: Construccin de un organismo concreto y

comparece con fenotipo.
Fenotipo: Propiedades observables de un carcter
controlado genticamente.
 Diferentes tipos de mutaciones

Mutaciones
espontneas Mutaciones Inducidas

Resultado de las
operaciones celulares
normales
Influencia de factores
externos
Sin agente especfico
asociado a ellas. Son
accidentales

Frecuencia 1pb en a
Frecuencia 1 pb en a
por generacin por generacin
 MUTACIONES GNICAS
Sustituciones de bases:cambio o sustitucin de
una base por otra en el ADN.

Transiciones:

Transversiones:

Fig. 2 Representacin Transicin y

transversin
 Tipos de Alteracin en la protena
Mutacin (Ejemplo)
Tripletes que codifican para el
Mutacin silenciosa mismo aminocido:
AAG(arg)CGG(arg)

Tripletes que codifican para

aminocidos equivalentes distintos.
Mutacin neutra
AAA(lys)AGA(arg). Ambos son
aminocidos bsicos

Aparece un nuevo triplete que

Mutacin cambio codifica para un aminocido de
de sentido distinto tipo. La protena pierde su
funcin.

Mutacin sin Aparece un triplete de terminacin o

Fig. 3 Tipos de mutaciones sentido FIN: CAG(gln)UAG(FIN)
 MUTACIONES ESPONTNEAS
Errores durante la replicacin.
1.-Tautomera

Forma imino de la
Citosina (C*)

Forma imino de
la Adenina (A*)

Fig. 4 Tautomera de las bases nitrogenadas

Fig. 5 Replicacin con tautomera origina transiciones
 LESIONES O DAOS FORTUITOS EN EL ADN
1.-Despurinizacin
2.-Desaminacin

Fig. 6 Desaminacin de la
Citosina y la 5- Metilcitosina
 3.-Daos oxidativos en el ADN

Fig. 7 Daos oxidativos en el DNA

INSERCIONES O ADICIONES Y
DELECIONES DE NUCLETIDOS

Fig. 8 Hiptesis de Streisinger

AGENTES
MUTAGNICOS
Agente fsico, qumico o biolgico
que altera o cambia la secuencia
nucleotdica, generando una
mutacin.

Agentes Fsicos
Radiacin UV (No ionizante)
Origina dmeros de Py intracatenarios
con creacin de una anillo ciclobutano
entre dos Py consecutivas

Rayos X (Radiacin ionizante)

Fig. 9 Estructuras de lesiones en el ADN
Forman radicales libres: inducidas por radiacin UV
Rupturas en los cromosomas.
Sustitucin, adicin o
eliminacin de bases.
 Figura 9. Formas
tautomricas de la
Timina y del 5-
Agentes Qumicos BrU

1) Anlogos de bases
Remplazan a las bases,
originan transiciones

5-bromouracilo (5-
BrU)

Figura 10. Mecanismo de

mutagenicidad del 5-BrU
 Ejemplo de una mutacin despus de 3 procesos de
replicacin

Figura 11. Generacin

de un error replicado por
5-BrU
2) Desaminacin Figura 13.
cido nitroso Mecanismo de
Desaminacin de C y G mutagenicidad del
origina transiciones. HNO2
Es una mutacin inducida
genticamente y con sentido falso.
Es en sentido bidireccional

Figura 12.
Desaminacin de
bases del DNA
Hidroxilamina

Acta especficamente sobre

la C aadindole un hidroxilo
a su grupo -NH2

Figura 14. Mecanismo de mutagenicidad del NH2OH

en el DNA
3) Agentes alquilantes
Sustancias qumicas que
donan grupos alquilos
(CH3 y CH3-CH2) a las
bases nucleotdicas.

Etil-metilsulfonato (EMS)

Figura 16. Mecanismo de

mutagenicidad del EMS en
el DNA

Figura 15. Anlogos de

bases
Figura 17. Alteracin de las bases del DNA por EMS,
HNO2 e Hidroxilamina
4) Agentes
intercalantes
Prdida o ganancia de
nucletidos generan
mutaciones de cambio de la
pauta de lectura del mensaje
gentico.
Figura 18. Estructura
del ICR-170
Figura 5. Mecanismo
de mutagenicidad de
los agentes
intercalantes

5) Bloqueadores del
emparejamiento de las
bases

Aflatoxina B1
Figura 19. Unin de la
Aflatoxina B1 en el N7 de
la guanina
 6) Agentes Biolgicos

La existencia de transposones o
elementos genticos mviles se
demostr en bacterias.

Tipos de transposones:

) Transposn Simple, Secuencia

de Insercin o Elemento de
Insercin (IS):los transposones
simples contienen una secuencia
central con informacin para la
transposasa y en los extremos una
secuencia repetida en orden inverso.

) Transposn Compuesto Figura 20. Transposn

simple y compuesto
(Tn):contienen un elemento de
insercin (IS) en cada extremo en
orden directo o inverso y una regin
central que adems suele contener
informacin de otro tipo.
Transposones: Son segmentos mviles de DNA
que pueden cambiar de posicin, trasladndose a
otro lugar dentro del mismo u otro cromosoma.
REVERSIN
Reversin:
Mutacin que restaura el fenotipo silvestre.

Reversin Verdadera:
2 mutacin que restaura el genotipo original, equivale a una
retromutacin.

Reversin supresora Intragnica

2 mutacin que tiene lugar en otro sitio del gen y suprime
los efectosde la 1 mutacin perono restaura el genotipo
original.

Reversin por Supresin:

2 mutacin que tiene lugar en otro gen y suprime los
efectosde la 1 mutacin perono restaura el genotipo original.
HIDROXILAMINA (HA) COMO AGENTE
MUTAGNICO EN NEUROSPORA CRASSA.
H. V. MALLING
BIOLOGY DIVISION, OAK RIDGE NATIONAL LABORALORY, OAK RIDGE,
TENN. (U.S.A.)
(RECEIVED JUNE 2IST, I000)

Antecedentes:
-La HA induce la sustitucin de G-C a A-T en fagos
-Clulas de mamferos que fueron previamente
tratadas con HA sin algn xito en la
identificacin de alteraciones genticas.
-Pruebas en la induccin de reversiones en
mutantes en un mtodo mas simple que la
induccin directa.
Objetivo:
Determinar el mecanismo de mutagenicidad de
HA en clulas eucariotes, mediante la induccin de
reversiones con mutgenos conocidos.

HIPTESIS
La HA inducir predominantemente
sustituciones de G-C a A-T en las clulas
eucariotes como en los fagos.
ORGANISMO UTILIZADO
Neurospora crassa (ad-3B)
Hongo Filamentoso
Phylum: Ascomycota
Crecimiento rpido
Ciclo de vida haploide
Presenta dos ncleos en cada conidio
Figura 21: Cultivo de
Neurospora crassa

Figura 22: Micelio y

microconidios de Neurospora
crassa
Materiales
Cepa
Mutantes prefijo 2-17 inducidos por Acido Nitroso

en la cepa de Neurospora del tipo silvestre 74 A.

Mutante 5-4-1 de origen espontneo.

Cultivo
Suspensin conidial en 20ml de medio glicerol
completo + sulfato de adenina (25mg/l)
Incubado 1 da/30C y 6-9 das/25C.
Posterior agitacin con perlas de vidrio y
resuspensin en solucin salina (0.9%), filtradas
a travs de un colador de platino, lavado 2 veces
por centrifugacin y resuspendidos en solucin
salina.
TRATAMIENTO CON CIDO NITROSO
(NA)
Cultivos suspendidos 1. Vol. De NaNO2
en buffer de Acetato 0.02M por 3 de sol.
de sodio 0.05M De conidios en
pH4.5 matraz.

Solucin Salina Mantener en

FRIES minimal agitador en bao
para detener la maria a 25C,
reaccin. durante 40 min.
TRATAMIENTO CON
METANOSULFONATO DE ETILO
(EMS)
Adicionar suficiente
Cultivo suspendidos
EMS para llegar a la
en buffer de Fosfato
concentracin final
0.067M pH 7.0.
0.1M

Solucin Salina Mantener en

FRIES minimal agitador en bao
para detener la mara a 25C
reaccin. 300min.
TRATAMIENTO CON ICR-170
Cultivos
1 vol. De ICR-
suspendidos en
170 por 49 vol.
buffer de
de cultivo CF:
Fosfato 0.067M
10.58M
pH 7.0

Solucin Salina
FRIES Mantener en
minimal para agitacin en
detener la bao mara a
reaccin. 25C 130min

Todo el
tratamiento bajo
Luz roja.
TRATAMIENTO CON
HIDROXILAMINA (HA)

Cultivo Y diluidos Centrifugar,

suspendido 5 veces en decantar y
en NaCl reaccin de resuspender
3M HA hasta en NaCl 3M
1M

Solucin Salina
FRIES Mantener en
minimal para agitador en
detener la bao Mara a
reaccin 25C 300min
ANLISIS ESTADSTICO

Se considera que el nmero de revertantes posee una distribucin de

Poisson y que ambas relaciones provienen de una misma poblacin:

Una probabilidad menor 5% indica una diferencia significativa entre el

nmero de reversiones en el control y las series tratadas.
 RESULTADOS
Tabla 1.- Porcentaje de supervivencia y frecuencia de reversiones de los
organismos despus del tratamiento con ICR.170, NA, EMS y HA

a
significa que la frecuencia de reversin no tiene una diferencia significante de la
frecuencia de mutacin espontanea al 5% de certeza .
Agente Mutagnico Alteracin Gnica Inducida
cido Nitroso (NA) Sustitucin de Bases

Metanosulfonato de Etilo (EMS) Sustitucin de Bases

ICR-170 Insercin o Delecin

Hidroxilamina (HA) Transicin


Figura 1. Incremento representado con base en la relacin: nmero de
reversiones registradas despus del tratamiento con HA (M) sobre el
nmero de mutaciones espontneas ( durante el tiempo de tratamiento
HA
Figura 2. Porcentaje de sobrevivencia vs tiempo de
tratamiento con HA

Figura 3. Cintica de la induccin de reversiones por el HA en la sustitucin de pares de
bases en el mutante 2-17-155. La frecuencia de reversiones por sobrevivientes vs el
tiempo de tratamiento con HA
PRACTICA 2: INDUCCIN DE
MUTANTES EN ESCHERICHIA COLI
Objetivos
Conocer y entender el manejo de algunas tcnicas
para producir mutaciones.

Analizar algunos parmetros que caracterizan el

proceso de mutacin, como la frecuencia de
mutacin y la relacin dosis-respuesta.

Caracterizar el dao producido por la luz

ultravioleta y la hidroxilamina, mediante
pruebas de reversin.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. Produccin de Mutantes
a. Tratamiento con hidroxilamina

1er. Da 2o. Da

Cepa
W3350

10 mL de medio L 4000x g Resuspender las clulas 5 mL de medio L

37C , agitacin 18h 10 min
 1 mL

9200 x g
Etiquetar 3 min Descartar el sobrenadante
del 1 al 5

Incubar Suspemder 1ml de

HA pH 6.0
37C con agitacin
30 min

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 M

Eliminar el Suspender
sobrenadante 1mL
solucin
9200 x g salina
3 min

Condiciones de
NaClO
Esterilidad
 Diluciones Decimales Todas las
TUBO DILUCI
Alcuotas diluciones
N se
Emplear 4.5 mL de medio L de 0.1ml
1 sembraran

por
Duplicado
2

3

Agar MacConkey
4
Determinar el numero de clulas Para el resto de
5
viables en cada tubo de las diluciones
tratamiento usar solucin
salina estril

Para permitir la 37C Incubar los tubos

expresin de los 18 h de los diferentes
probables tratamiento 37C
mutaciones
18 h
b. Tratamiento con luz ultravioleta
1er. Da 2o. Da
Nafelomtrico
37C , agitacin 1.5 h
Densidad
ptica de 60
unidades
Cepa Klett,equivalen
W3350 te a A=0.12

10 mL de medio L Dilucin 1:20 4000x g

37C , agitacin 18h 20 mL de medio L 15 min

Resuspender 6 mL de solucin salina

 Para
determinar
cuenta viable 4.5 mL de medio L
T=0 seg
Irradiacin
UV 15, 30, 45 y 60 seg
500 L suspensin
5.5 mL suspensin

Se preparan con
solucin salina estril
Muestra de 0.5 mL
Duplicado
Sembrar
0.1 mL suspensin TIEMPO DILUCI 4.5 mL
de
DE N medio L
IRRADIA
37C
18-24 h CIN
Agar MacConkey Dil.
(seg)
1 10-1
Por
espatulado 2
Con
caldo L

3
37C
18 h 4
 Recuperar los mutantes Lac (colonias blancas) a-10 y b-9

1. Ttulo clulas viables

2. Grfica de % sobrevivencia

Agar MacConkey

3er. Da
Contar colonias sobrevivientes
a-9 y b-8
Sembrar una caja
de las dil. 10-6 y 2
de dil. 10-7 y 10-8
0.1 mL
Tcnica espatulado
37C
18 h
4o. Da
Agar MacConkey
1. Contar total colonias y Lac
2. Calcular FM FM=Titulo de mutantes/
3. Curva Dosis-respuesta Titulo de sobrevivientes Frecuencia de
mutacin
BIBLIOGRAFA
Brown, T.A. (2008). Genomas. 3ed. Buenos Aires. Editorial
Mdica Panamericana.
Drake, J. W. y Baltz, R.H. 1976. Bioqumica de la
Mutagnesis pp 11-37.
A. Jimenez Sanchez y R. Guerrero. Genetica Molecular
Bacteriana. Ed Reverte. 1982. Espaa pp. 3-20
http://
pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutaci
on/mutacion.htm
Alicia Espinosa L. Experimentos en Genetica Microbiana.
2017. Mxico. pp 12-13
Mathews.Bioqumica.4ta ed. Mxico, D.F, 2013.: Pearson