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Secuenciacin qumica y

mtodo de Sanger.
Jessica Cortes Pegueros.
Luis Miguel Martnez Hernndez.
Mayra Soleil Ricrdez Vadillo.
Cruz Liliana Velzquez Velzquez.
Secuenciacin

La secuenciacin del DNA es un conjunto de mtodos


y tcnicas bioqumicas, la cual tiene como finalidad
determinar la cantidad y orden de nucletidos (A, T, C,
y G).

La secuenciacin es una herramienta para el estudio


de la investigacin de mutaciones, procesos biolgicos
y en campos aplicados como la investigacin forense.
La estrategia bsica de la secuenciacin de cidos nucleicos es
idntica a la que se utiliza en la secuenciacin de protenas. sta
involucra:

1.- La degradacin especfica y el fraccionamiento de los


polinucletidos de inters a fragmentos suficientemente pequeos
para ser secuenciados.

2.- La secuenciacin de los fragmentos pequeos.

3.- El ordenamiento de los fragmentos a travs de la repeticin de los


pasos anteriores, usando un procedimiento de degradacin que
produce una serie de fragmentos de polinucletidos que traslapan el
punto de corte en la primera serie
Secuenciacin qumica
(mtodo de maxam y Gilbert)

En este mtodo, un fragmento de ADN de cadena


doble o sencilla se marca en los extremos 5 o 3 de
una o ambas hebras con 32P.

Despus, la muestra de ADN se divide en cuatro


alcuotas y se fragmenta en cuatro reacciones
qumicas distintas.

Posteriormente, los fragmentos de ADN generados


pueden ser separados por electroforesis en cuatro
carriles distintos con base en su tamao.

Conociendo el nucletido en el que se realizaron los


cortes, se puede inferir la secuencia de la molcula
original.
Las reacciones qumicas que se utilizan para fragmentar la molcula de ADN son
las siguientes:

1. Corte de las purinas: las purinas (A y G) se metilan con dimetil sulfato (DMS).
Despus la reaccin es tratada en condiciones alcalinas, la cadena de DNA se
fragmentar en las purinas metiladas.

2. Corte de adeninas: las purinas se tratan con un acido diluido para favorecer el
corte de adeninas metiladas. Despus de un tratamiento alcalino las guaninas son
cortadas.

3. Corte de pirimidinas: Esta reaccin utiliza el reactivo hidracina, que corta las
bases citosina y timina. Posteriormente, se trata con piperidina para completar la
reaccin.

4. Corte de citosina: La presencia de NaCl 2M inhibe la reaccin de hidracina con


tiamina, y el tratamiento posterior con piperidina, produce solamente fragmentos
que terminan en citosina.
VENTAJAS DESVENTAJAS

Baja resolucin debido a una


limtate de geles de acrilamida y el
ensanchamiento de bandas cuyas
secuencias favorecen la formacin
Es el ms adecuado para de estructuras secundarias.
determinar la secuencia
de fragmentos cortos de Se necesita separar y analizar
individualmente las hebras de DNA
DNA, puede determinar la que se requieran secuenciar
secuencia desde la (enzimas de restriccin o geles).
primera base.
Mtodo de sanger
En qu consiste?
1.- El Mtodo se basa en el uso de la DNA polimerasa para sintetizar cadenas
de ADN con terminacin especfica.

2.-Se basa en el empleo de dideoxinucletidos

3.-Es el mtodo ms utilizado en la actualidad, emplea la electroforesis capilar


permitiendo su automatizacin.

4.- Con este mtodo se generan fragmentos de ADN de todos los tamaos
posibles que se puedan distinguir entre s, por el tipo de marcaje que llevan o
por la incorporacin de un terminador especfico.

5.Secuenciacin de 900 pdb


Elementos principales
El ADN molde o segmento de ADN
Gran cantidad de ese fragmento
Estado de hlice sencilla.

Enzima ADN polimerasa

Cebador o "primer"
Oligonucletido corto de alrededor de 20 bases
secuencia complementaria al vector empleado
suele marcarse radiactivamente o con fluorescencia

Nucletidos trifosfato
dATP, dCTP, dGTP y dTTP

Nucletidos didesoxi
ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP
Han perdido el grupo hidroxilo de la posicin 3'
Mtodo electroforesis capilar en gel
Mtodo electroforesis en gel de acrilamida
Preparar 4 tubos diferentes Se separan por tamaos
con: 4 nucletidos trifosfato, Produccin de molculas de
mediante electroforesis en
ADN polimerasa I ADN de nueva sntesis de
geles verticales de
diferente longitud marcadas
un cebador marcado acrilamida muy finos (0,5
todas radiactivamente por el
radiactivamente mm de espesor) y de gran
extremo 5
un nucletido didesoxi longitud (cerca de 50 cm)

Lectura del gel por los


fragmentos de menor Los productos de cada una
tamao (extremo 5') y El gel se pone en contacto de las cuatro mezclas de
avanzamos hacia 3, con una pelcula fotogrfica reaccin se insertan en
obtendremos la secuencia de autorradiografa. cuatro calles o carriles
del ADN de nueva sntesis diferentes del gel.
en la direccin 5' 3'.
Limitaciones
Avance de desarrollo de mtodos de secuenciacin de cidos nucleicos. (mtodo sanger)
Bibliografa
De Necochea Campion, R. and Canul Tec, J. (2004). MTODOS FISICOQUMICOS EN BIOTECNOLOGA:
SECUENCIACIN DE CIDOS NUCLEICOS. 1st ed. [ebook] Cuernavaca, Mor: INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA-
UNAM, pp.13-19. Available at: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf [Accessed
13 Feb. 2017].