PRUEBAS BIOQUMICAS

DE IDENTIFICACIN
TSI (TRIPLE AZCAR HIERRO AGAR)
Medio universalmente empleado para la
diferenciacin de enterobacterias, en base a la
fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la
produccin de cido sulfhdrico.
TSI (TRIPLE AZCAR HIERRO
AGAR)
Fundamento: Sirve para detectar la fermentacin
de hidratos de carbono. El medio contiene: glucosa
al 0.1%, lactosa 1%, sacarosa al 1% y peptonas;
tambin tiene un indicador rojo de fenol y El
tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro
y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se
combinan con el cido sulfhdrico y producen
sulfuro de hierro, de color negro.
Procedimiento: El medio se fracciona en picos de
flauta con una capa basal profunda (2 cm. por lo
menos). Con el ansa en punta se siembra por
puncin y estra.
El medio no inoculado es anaranjado-rojizo o rojo
plido. Incubar 24 hs a 35 C.
TRIPLE AZCAR HIERRO
TSI (TRIPLE AZCAR HIERRO AGAR)

Interpretacin:
Fermentacin de la glucosa (alcalino/cido)
Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa,
produciendo cidos y virando totalmente el medio a color amarillo.
Como solamente utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la
lactosa, cuando la glucosa que se halla en baja concentracin se
consume (antes de las 24hs) los microorganismos comienzan a
utilizar la peptonas con produccin de amonaco que alcaliniza el
medio dando un color rojo, pero solamente en el pico, quedando el
fondo cido.
Fermentacin de glucosa, lactosa y sacarosa (cido/cido)
Como la lactosa y sacarosa estn en una proporcin 10 veces mayor
que la glucosa, en un perodo de 24hs., la lactosa y sacarosa, an no
se consumen quedando cido el medio o sea totalmente amarillo.
No fermentacin de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino).
Un microorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos
de carbono, lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son
degradadas libran amonaco y alcalinizan el medio. Producindose
entonces intensificacin del color.
CONSIDERACIONES DEL TSI

Es importante respetar el tiempo de lectura, porque si el

caso 1 se lee antes de las 24hs. se va a interpretar como
ac/ac y no lo es. Si el 2 se lee despus de las 24hs, los
microorganismo ya se quedan sin hidratos de carbono,
entonces comienzan a utilizar las peptonas y se alcaliniza el
medio.
Con respecto al sulfhdrico pueden presentarse distintas
modalidades:
Pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro y formacin
de gas, esto se puede dar en Salmonella, se lee: alc/ac
(SH2) (gas)
Tambin se puede ver totalmente amarillo y el fondo negro:
se lee: ac/ac (SH2).
Adems se puede visualizar en el tubo la produccin de
gas por parte del microorganismo, entonces en el medio se
observan burbujas, resquebrajamiento, o si no todo el
medio de cultivo aparece levantado.
 LISINA HIERRO AGAR (LIA)

Medio de cultivo utilizado para diferenciar

microorganismos, especialmente Salmonella spp.,
basado en la decarboxilacin / desaminacin de
la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico.
 FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los
nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono
fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de
las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el
tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico.
El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo
a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por
decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el
medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La
decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es
necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de
cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin
de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio
debido a la formacin de sulfuro de hierro. Las cepas de los gneros Proteus,
Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce
un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia
del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
LIA:
Agar de ensayo para la demostracin simultnea de lisina decarboxilasa
(LD) y de la formacin de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificacin
de enterobacterias.
La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivas
que la transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al
violeta del indicador de pH prpura de bromocresol,puesto que la
descarboxilacin slo tiene lugar en medio cido (pH inferior a
6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificacin del medio
decultivo, por fermentacin de la glucosa. Este medio de cultivo solo
puede utilizarse para la diferenciacin de bacterias que fermentan
glucosa.
Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa,
producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La
incubacin prolongada puede ocasionar alcalinizacin en la zona de la
superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al
violeta. La formacin de H2S produce una coloracin negra debido al
sulfuro de hierro producido.
LISINA HIERRO AGAR (LIA)

LIA SH2 - LIA + SH2 - LIA + SH2 -

 RESULTADOS

1- Decarboxilacin de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminacin de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas
del gnero Proteus, Providencia y alguna cepas de
Morganella spp.
3-Produccin de cido sulfhdrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio
(especialmente en el lmite del pico y fondo)
 AGAR SIM

Es un medio semislido destinado a verificar la

movilidad, produccin de indol y de sulfuro de
hidrgeno en un mismo tubo. Es til para
diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
 FUNDAMENTO

El triptfano es un aminocido constituyente de muchas

peptonas, y particularmente de la triptena, que puede
ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En
el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas
triptofanasa. El indol producido se combina con el
aldehido del reactivo de Kovac s o de Erlich, para
originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles
pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que
producen alrededor de la puncin de siembra, mientras
que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se
distinguen por la formacin de un precipitado negro de
sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el
medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
 RESULTADOS

Cepas mviles: producen turbidez del medio, que

se extiende mas all de la lnea de siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa
solamente en la lnea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de
la lnea de siembra o en todo el medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin
cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego
de agregar el reactivo de Kovac s o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.
 PRUEBA DE INDOL

FUNDAMENTO:
TRIPTOFANASA
H2O + TRIPTOFANO INDOL + AC. PIRUVICO + NH3

PROTOCOLO: Se inocula en caldo triptosa e incuba a 35 -

37C durante 24 horas.
Luego de este perodo, se aaden 5 gotas del reactivo de
Kovacs.

INTERPRETACIN:

NEGATIVO POSITIVO

POSITIVO NEGATIVO
 CITRATO DE SIMMONS AGAR

Medio utilizado para la diferenciacin de

enterobacterias, en base a la capacidad de usar
citrato como nica fuente de carbono y energa.
 FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de
nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos
componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales
de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor
enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el
azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en
medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los
microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de
carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con
la consiguiente produccin de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias
poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido
tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente,
oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio
alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como
fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El
medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de
citrato permeasa.
 RESULTADOS

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico,

alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color verde
debido a que no hay desarrollo bacteriano y no
hay cambio de color
 CALDO UREA

Medio utilizado para la identificacin de

microorganismos, en base a la actividad uresica.
Es particularmente til para diferenciar Proteus
spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
 FUNDAMENTO

Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart,

presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad
buffer. El extracto de levadura es la nica fuente de
carbono, nitrgeno, vitaminas y cofactores, y aporta los
nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las
sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de
fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la
enzima ureasa. Aquellas bacterias que poseen la enzima
ureasa, pueden utilizar el nitrogeno proveniente de la urea,
la hidrolizan, liberando amonaco y dixido de carbono.
Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo
virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo. Su uso, se
recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros gneros.
RESULTADOS