PCR en Tiempo Real

Repasemos

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Tcnica que permite copiar o replicar millones de veces

pequeas cantidades de ADN in vitro.

MUY SENSIBLE
Y
MUY ESPECFICA
 PCR
PCR

Molcula de ADN polimerasa

ADN (molde) termoestable

Cebador sentido Cebador Antisentido

dNTPs (A;G;T;C) Cofactor Mg2+

 PCR
Tres pasos bsicos

Desnaturalizacin

Primers
complementarios

Apareamiento

Elongacin
PCR
 PCR

Verificacin del producto de PCR

en gel de agarosa

Marcador de tamao molecular Productos de PCR

La PCR puede ser
cuantitativa?
 PCR en Tiempo Real
En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificacin
y deteccin se producen de manera simultnea en el
mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna accin
posterior.

Adems, mediante deteccin por fluorescencia se

puede medir durante la amplificacin la cantidad de
ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisin
de fluorescencia producida en la reaccin es
proporcional a la cantidad de ADN formado.
 PCR en tiempo
Northern Blot PCR tradicional
real

Semi-
Gold Standard Cuantitativa
cuantitativa
No requieren Requiere
Requiere
amplificacin amplificacin
amplificacin
Grandes Pequeas
Pequeas
cantidades de cantidades
cantidades
ARN de ARN
de ARN
Radioactivida Sensible
Sensible
d
PCR en
PCRTiempo
en tiempoReal: Pasos
real: Pasos

Aislamiento y Caracterizacin ARN

Sntesis de cDNA

Adquisicin datos de Real Time PCR

Generacin de factores de normalizacin

Datos normalizados

Anlisis de Datos
PCRPCR
en en
Tiempo Real
tiempo real

Aislamiento y Caracterizacin del ARN

Extraccin de
ARN

28 S
18 S

5S

28 S
18 S

5S
Muestra
 PCRPCR
en en
Tiempo Real
tiempo real

mRNA cDNA
Retrovirus

Transcriptasa Reversa hace el cDNA complementario del RNA

 PCRPCR
en en
Tiempo Real
tiempo real

Transcripcin Reversa (RT-PCR)

OligodT se
une al mARN

mRNA cDNA

Copia de la primera
hebra de cDNA

Digestin y
desplazamiento
del mARN

Copia de la segunda
hebra de cDNA
 PCR en Tiempo Real
DETECCIN: AGENTES
INTERCALANTES O SONDAS

Molcula de ADN polimerasa

ADN (molde) termoestable

Cebador sentido Cebador Antisentido

dNTPs (A;G;T;C) Cofactor Mg2+

 PCR en tiempo real
Mtodos de Deteccin

Agentes intercalantes

Sondas de Hibridacin
 PCR en tiempo real
Colorantes de unin al ADN: SYBR GREEN

Unin al surco menor del ADN doble cadena.

Emite fluorescencia cuando est unido al ADN doble

cadena (dsADN).

La intensidad de fluorescencia aumenta

proporcionalmente a la concentracin de dsADN.
 PCR en tiempo real
Colorantes de unin al ADN: SYBR GREEN

No se unen de manera secuencia-especfica, pueden generar falsos positivos.

Se puede usar un colorante para evaluar varios genes.

No se puede usar para reacciones en multiplex.

Los diferentes productos de PCR se reflejan en la temperatura de melting (Tm).

 PCR en tiempo real
Sondas de Hibridacin

Se necesitan 2 primers y dos sondas especficas de secuencia.

Las sondas se unen en un arreglo cabeza con cola.

La primera sonda (upstream) est marcada con un fluorforo

donante (D) en el extremo 3. La segunda sonda (downstream) est
marcada con un fluorforo aceptor (A) en el extremo 5.

Fluorforo Donante Fluorforo Aceptor

 PCR en tiempo real
Sondas de Hibridacin

Cuando se unen, los fluorforos experimentan una

transferencia de energa (FRET) del fluorforo
donante al aceptor con aumento de fluorescencia.
 PCR en tiempo real
Sondas de Hidrlisis: Sondas Taq Man

La sonda se hibrida con el amplicn blanco.

Se encuentra bloqueada en el extremo 3

(fosforilada, no puede ser amplificado por la
polimerasa).

Tiene dos colorantes fluorescentes unidos

(R= reportero y Q= quencher).

El Q reduce la intensidad de fluorescencia

del reportero cuando la sonda est intacta.
 PCR en tiempo real
Sondas de Hidrlisis: Sondas Taq Man

Mtodo consiste de 2 primers y dos

sonas especficas de secuencia. Desnaturalizacin

Pegado de primers y sondas

Extensin por la ADN Polimerasa

Sirve para evaluar mltiples genes con

Extensin por la ADN Polimerasa y clivaje del Reportero
distintos colorantes (multiplex).

Fluorescencia
 PCR en tiempo real
Molecular Beacons

Es una sonda en horquilla.

Tiene una regin especfica de secuencia

flanqueada por dos repeticiones invertidas.

Los fluorforos reportero y quencher estn

unidos a los extremos, reduciendo la
fluorescencia cuando est libre en solucin.

Cuando se unen a la secuencia, el Q y el R se

separan, permitiendo la emisim del R.
 PCR en tiempo real
Molecular Beacons
Tienen mayor sensibilidad que las sondas lineares.

Aplicacin: Discriminacin de alelos con fluorforos distintos.

PCR en Tiempo Real
 PCR en Tiempo Real
El sistema de real time PCR se basa en la deteccin y cuantificacin
de un reportero fluorescente.
Puede monitorearse la reaccin de PCR en la fase exponencial.

Se utilizan aparatos, placas y programas especiales para llevar a cabo

la reaccin y anlisis de datos.
 PCR en Tiempo Real
Las reacciones se caracterizan por el punto en el
tiempo (ciclo de PCR) donde la amplificacin es
detectada por primera vez: Ct o Cp.

El Ct es el tiempo al cual la intensidad de fluorescencia

es mayor que la fluorescencia de fondo (umbral de
deteccin = threshold).

Fase Plateau

Fase Exponencial
 PCR en Tiempo Real
Cuanto mayor cantidad de ADN inicial, habr un
aumento ms rpido de la seal fluorescente, resultando
en un Ct ms bajo.
 PCR en Tiempo Real
Cuantificacin Absoluta
Se determina la concentracin de las muestras.
Se necesita un estndar (ARN, ADN o cADN) cuya concentracin se
conozca con total exactitud.
Se realiza una curva de diluciones con las concentraciones conocidas
del estndar.
Se intrapola el valor de Ct obtenido para conocer la concentracin de
ADN inicial de la muestra.
Se utiliza para determinar la carga viral de una muestra.
 PCR en Tiempo Real
Cuantificacin Relativa
Se necesita un control interno o calibrador (housekeeping gene).
Se determina cambios en el nivel de expresin de las muestras
basados en una muestra de referencia o estndar.
Se utiliza para comparar los niveles de expresin de un
determinado gen en muestras diferentes (por ejemplo tratadas o
no).
PCR tradicional vs. PCR en tiempo real
 PCR en tiempo real
Beneficios
No requiere manipulacin post-amplificacin.
Mtodo muy sensible.
Puede detectar una simple copia de un transcripto especfico.
Puede detectar diferencias de expresin menores al 23%.
Requiere menos cantidad de RNA.
Desventajas

Requiere equipamiento y reactivos muy costosos.

Debido a su alta sensibilidad, se necesita un correcto diseo

experimental y tcnicas de normalizacin para obtener
conclusiones precisas.
 PCRPCR
enentiempo real
tiempo real
Aplicaciones en Investigacin

DNA:
Identificacin de genes de virulencia o de resistencia a drogas.
Genotipificacin de cepas o subespecies
Deteccin de mutaciones puntuales
Estudio de de polimorfismos de un solo nucletido (SNPs)
Cuantificacin del nmero de copias por clula, o determinacin de clulas
iniciales en una muestra.
RNA:
Deteccin de la expresin de genes
Efecto de mutaciones sobre la expresin
Anlisis de mRNAs variantes producidos por procesamiento diferencial
Cuantificacin de la expresin
 PCRPCR
enentiempo
tiempo real
real
Aplicaciones en Diagnstico Clnico

Deteccin /Cuantificacin / Genotipificacin de patgenos:

Virales (carga viral, carga pro-viral)
Bacterianos
Protozoarios
Hongos

Diagnstico temprano (pacientes asintomticos)

Deteccin de genes de resistencia mejor eleccin de terapia

Monitoreo de terapia (enfermedad residual - recada)

Deteccin de marcadores tumorales

Estado del desarrollo / progresin de la enfermedad

 Aplicaciones de la Real Time PCR en el
diagnstico de la sepsis neonatal
LightCycler SeptiFast Test MGRADE
- Resultado en 6 horas
- 1.5 ml de sangre
- Sin incubacin previa
 Probe Tm

E. Coli 52C
P. Aeruginosa 57C
 Aplicaciones de la Real Time PCR en el diagnstico de la
infeccin por C. Trachomatis y N. gonorrhoeae
COBAS AMPLICOR CT/NG Test (Roche )

Test cualitativo para la deteccin de C. Trachomatis y N.

gonorrhoeae

Muestras: orina, hisopados endocervicales

y uretrales

1) Amplificacin de las secuencias blanco mediante Real

Time PCR con cebadores especficos
2) Hibridacin con sondas especficas para los dos agentes
3) Deteccin de los amplicones unidos a la sonda mediante
una determinacin colorimtrica
Aplicaciones de la Real Time PCR en la determinacin de
la variante del rs12979860 del gen IL28B

PREDICE LA
RESPUESTA AL
TRATAMIENTO
ANTIVIRAL EN
PACIENTES HCV +